[發明專利]一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物及其制備方法

在審

• 申請號: 201710419496.X
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN106995859A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: 王利鋒;陳銳;肖覺;鄭曉東;袁芳;宋容
• 申請（專利權）人: 重慶市腫瘤研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/531
• 代理公司: 重慶華科專利事務所50123
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明屬于生物病理檢測領域，具體涉及一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物及其制備方法。

背景技術

在目前臨床組織病理診斷和形態學的研究中，原位雜交和免疫組織化學染色已經成為不可或缺的病理診斷輔助技術，在全球臨床病理檢測中已經得到廣泛應用，成為了臨床病理檢測常規工作中不可缺少的部分。這兩種常規檢測方法不僅提高了病理診斷的準確性，同時也滲透到了臨床和基礎學科，在探討疾病的病因學、發病機制及科研工作中起到了不可估量的作用。如EBER原位雜交檢測在多種惡性腫瘤特別是鼻咽癌的病理診斷中起著十分重要的作用，能夠確定病毒與組織和細胞的關系，在確定EBV與疾病關系時，EBER原位雜交已成為公認的標準檢測方法；又如在乳腺癌組織中，ER、PR及C—erbB-2的免疫組化檢測可為患者的預后判斷、個體化治療和靶向治療方案的選擇提供幫助。

但由于原位雜交和免疫組化的染色過程比較復雜，影響染色結果的因素也很多，如一些實驗條件的差別及其他技術因素的影響，使得最終的染色結果差別很大，從而影響到病理診斷的結果，目前提高原位雜交和免疫組化染色技術水平的需要越來越迫切，而且任重道遠。在日常的病理檢測中，為保證結果的穩定和可信，常用的方法是在病理檢測中設置陽性對照對實驗過程進行質控。臨床常用的陽性質控方法主要有兩種:一種是每次在對待檢組織進行檢測時，都使用和待檢組織同樣的方法將已知表達為陽性的組織(簡稱陽性組織)制成蠟塊，然后將制備的陽性對照蠟塊和待檢組織蠟塊裱在同一張載玻片上，進行檢測，該方法陽性對照與待檢組織實驗條件一致，具有結果可比性好和誤差小等優點，但該方法每進行一次檢測，均需要制備陽性對照蠟塊，不僅需要耗費大量的陽性對照組織、試劑等，而且操作繁瑣，工作量大，大大降低了檢測效率；另一種是組織微陣列(TMA)技術，通過一次性將多個陽性組織轉移到一個新石蠟塊上，構建高通量陽性組織陣列的方法在一定程度上提高了檢測效率，但依然存在制作過程煩瑣，所占的面積較大，需耗費大量抗體試劑等缺點，制約其在臨床上的推廣應用。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的一個目的是提供一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物，所述陽性參照物鏡下觀察組織形態完整，使用方便，保存時間長，制備方法簡單，節約試劑成本。

本發明的另一個目的是提供一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物的制備方法，所述方法僅需一次操作即可制備出能夠供多次檢測使用、組織形態完整且保存時間長的陽性參照物，實驗操作簡單方便、成本節約且大大提高檢測效率。

為實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物，由以下方法制備得到：

步驟1：將已知原位雜交或免疫組化染色陽性的腫瘤組織用福爾馬林緩沖液固定，切成(1.0-2.0)cm×(1.0-2.0)cm、厚度為(0.3-0.4)cm的組織塊，脫水、浸蠟,石蠟包埋制得陽性組織蠟塊，HE染色定位，選擇陽性組織蠟塊上代表性病變組織區域；

步驟2：將石蠟和蜂蠟按質量比50:1的比例混合熔化成蠟液，將所得蠟液注入包埋模具中，冷卻，制得空白蠟塊，用內徑為0.8-2.0mm的組織芯片穿刺針在空白蠟塊中穿刺打孔；

步驟3：用內徑為0.8-2.0mm的組織芯片穿刺針在步驟1所得的代表性病變組織蠟塊穿刺取樣后置入步驟2所得的空白蠟塊穿刺孔中，加熱使加入的病變組織與蠟塊融合，冷卻，燙熔表面,加上塑料組織包埋框和石蠟液，冷凍，脫模制得組織芯片蠟塊；

步驟4：將步驟3所得的組織芯片蠟塊切成厚度為4-10um的薄片，二甲苯溶解石蠟，離心，棄上清液，100％乙醇洗滌，離心，棄上清液，95％乙醇洗滌，離心，棄上清液，加入95-100％乙醇稀釋至每毫升溶液中含500-1000個組織片段的陽性參照物，4℃保存備用，所述的95％乙醇、95-100％乙醇是指乙醇體積分數為95％、95-100％的乙醇水溶液。

根據本發明所述的陽性參照物，步驟1中所述的福爾馬林緩沖液的濃度為10％。

根據本發明所述的陽性參照物，步驟1中所述的組織塊為1.5cm×1.5cm、厚0.3cm。

根據本發明所述的陽性參照物，步驟1中所述的脫水為全自動密閉式脫水機脫水。

根據本發明所述的陽性參照物，步驟1中所述HE染色定位的方法是將陽性組織蠟塊切片，HE染色，顯微鏡觀察有代表性病變組織，定位。

根據本發明所述的陽性參照物，步驟3中所述的組織芯片穿刺針的直徑為1.0mm。