[發明專利]Blec蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710418299.6
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107446893B
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 韓凌霞;廉傳江;趙麗麗;張圓圓;陳洪巖
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/18;G01N33/68;C12R1/91
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;張瑞雪

本發明公開了Blec蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用。本發明以原核表達的Blec蛋白為免疫原免疫鼠，將免疫鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，經過多次篩選和亞克隆，獲得特異性的單克隆細胞株blec?3D3以及由其分泌的單抗blec?3D3。利用單抗blec?3D3對雞外周血淋巴細胞進行流式細胞術檢測，結果表明blec蛋白主要表達于CD3+和CD4+細胞；免疫組化檢測結果表明，單抗blec?3D3能在雞黏膜免疫相關組織檢測到特異性信號。本發明提供的blec單抗可作為檢測抗體檢測動物組織或細胞內的Blec蛋白的分布、表達或生物學功能。

技術領域

本發明涉及雞C-型凝集素樣受體蛋白Blec單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發明進一步涉及它們在檢測blec蛋白的組織學分布、體內和體外表達中的應用，屬于雞凝集素樣受體蛋白Blec單克隆抗體的制備和應用領域。

背景技術

雞blec基因位于主要組織相容性復合體(Major histocompability complex,MHC)的核心區域，在不同單倍型之間保守性較強。根據編碼蛋白的推導氨基酸序列分析，為C-型凝集素樣結構，可能與雞的自然殺傷細胞非MHC I類分子介導的細胞殺傷功能有關。但至今blec蛋白的結構、在雞體內的組織學分布尚未見明確報道。

利用Blec蛋白特異性單克隆抗體，可通過免疫組織化學技術分析雞體內blec蛋白的組織學分布，這對于研究blec蛋白的結構、生物學功能以及在雞體內的組織學分布具有重要的價值。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是提供一株穩定分泌Blec蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

本發明所要解決的第二個技術問題是將該雜交瘤細胞株分泌的Blec蛋白單克隆抗體應用于檢測雞體內的Blec蛋白的表達或分布。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

本發明為獲得MHC單倍型雞保守的blec蛋白特異性單抗，并適合于blec蛋白功能研究，本發明根據網上公布的所有不同單倍型雞Blec基因序列，比對推導氨基酸序列結果，發現存在5個變異位點，為了獲得適用于表面配體功能分析的單抗，本發明最終確定選擇Ala59-Leu176區域進行表達。選擇最保守的B21單倍型雞為實驗材料，參考標準序列設計引物，擴增blec胞外區(Ala59-Leu176)基因，構建pET-Blec21重組質粒，以保證獲得型通用型單抗。IPTG誘導pET-blec21原核表達重組菌，超聲波破碎，用鹽酸胍處理，獲得包涵體；在復性液中復性，濃縮，凝膠過濾層析柱中純化蛋白，獲得純化的Blec蛋白。

取7周齡無特定病原體BALB/c雌性小鼠，用純化的blec蛋白進行免疫，50μg/小鼠，腹腔注射。每隔2周免疫一次，第3次免疫后一周采集免疫鼠血，37℃放置1h，4℃離心10min分離血清。將血清倍比稀釋，用間接ELISA檢測血清效價，選擇血清效價最高的小鼠于融合前3天加強免疫。將免疫鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，經過3次篩選和3次亞克隆，獲得特異性強、穩定性好的單克隆細胞株blec-3D3。

本發明對單克隆細胞株blec-3D3進行亞類鑒定，鑒定結果顯示，blec-3D3的重鏈是IgM，輕鏈為Kappa鏈。

Western blot鑒定結果表明，blec-3D3能特異性檢測到雞體內黏膜免疫相關組織中的Blec蛋白。

本發明將分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株blec-3D3提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No.12998；分類命名為：BALB/c小鼠雜交瘤細胞。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2016年10月26日；保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

流式細胞術檢測結果表明，應用本發明的Blec單抗可用于檢測雞外周血中表面表達blec蛋白的細胞種類。