[發明專利]一種磁分離RCA合成DNA酶檢測金黃色葡萄球菌的方法

在審

• 申請號: 201710415904.4
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107236795A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 沈曉芳;李雙雙;龐月紅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種磁分離RCA合成DNA酶檢測金黃色葡萄球菌的方法，屬于食品安全技術領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)大量存在于自然界中，是一種典型的球型革蘭氏陽性菌。金葡菌對生長環境要求不嚴，肉類、魚類、乳制品等絕大多數食品都可為其提供良好的生長條件，在適宜的溫度下，可產生耐高溫的腸毒素從而引發食物中毒。我國每年發生大量由金葡菌引起的食物中毒事件，其主要表現癥狀為嘔吐和腹瀉。因此，對金葡菌作出快速、精確的檢測十分重要。

傳統檢測金葡菌的方法為根據國標法對其進行分離培養和生化鑒別，存在檢測耗時、操作繁瑣、檢測限高等缺點，無法達到現今食品中微生物安全性的要求。隨著生物技術的快速發展，許多新型快速檢測技術得到了廣泛的研究和應用，如PCR技術、免疫學技術、生物傳感器和基因芯片技術等。

滾環擴增技術(Rolling circle amplification，RCA)是近幾年發展起來的一種等溫條件下的DNA復制技術，以短寡核苷酸鏈為引物，線性單鏈DNA序列形成環狀模板，運用具有鏈置換作用的DNA聚合酶使引物生成包含若干串聯重復序列互補環狀模板的線性長鏈DNA分子。RCA具有操作簡單、高特異性、擴增效率高、產物穩定等優點。DNA酶是一段能形成G-四鏈體的核苷酸序列結合氯化血紅素后模擬過氧化物酶功能的復合物，可催化H₂O₂與魯米諾的化學發光反應。滾環擴增合成DNA酶，結合了滾環擴增的信號放大作用和DNA酶的催化作用，雙重放大。

近年來，許多研究將DNA夾心雜交原理結合納米材料應用于致病菌的檢測，但其中也存在著一些檢測限高、靈敏度低和操作復雜等問題。因此，有必要建立一種檢測限低、靈敏度高且操作簡單的檢測金黃色葡萄球菌的方法。

發明內容

為了解決目前存在的金黃色葡萄球菌檢測限高等問題，本發明提供了一種磁分離滾環擴增合成DNA酶檢測金黃色葡萄球菌的方法。本發明方法，將金黃色葡萄球菌的16S rDNA為一段特異性檢測的目標DNA片段，使用特異性探針修飾的磁納米粒子來結合和分離金葡菌的16S rDNA，不僅利用磁納米粒子的磁性分離作用，還利用探針和金葡菌16S rDNA間特異性的互補配對作用，從而快速地從復雜組分中分離金葡菌16S rDNA，并有效結合滾環擴增技術合成的DNA酶催化H₂O₂-魯米諾反應系統來實現信號的雙重放大和檢測。

本發明利用DNA夾心雜交原理設計了兩條特異性的探針——捕獲探針和信號探針。將捕獲探針修飾到磁納米粒子表面，該材料可快速地從復雜組分中結合和分離金黃色葡萄球菌的目標DNA序列，再加入包含滾環擴增引物的信號探針與目標DNA序列互補雜交形成夾心結構，然后滾環擴增引物與相應包含DNA酶互補序列的模板互補配對引發滾環擴增反應合成DNA酶，利用DNA酶進行催化H₂O₂-魯米諾化學發光反應系統，根據相對發光值的變化來定量檢測金葡菌。在一定范圍內，金黃色葡萄球菌的濃度與相對發光值的變化呈線性相關，可達到對金黃色葡萄球菌定量檢測的目的。

本發明方法，包括如下步驟：

(5)先將捕獲探針與親和素修飾的磁納米粒子(Avidin-MNPs)混勻、孵育，使捕獲探針修飾到磁納米粒子表面，得到捕獲探針功能化的磁納米粒子；所述捕獲探針功能化的磁納米粒子能夠結合金黃色葡萄球菌的目標DNA序列；

(6)將捕獲探針功能化的磁納米粒子與含目標DNA序列的待測液孵育，然后加入信號探針，使目標DNA序列與捕獲探針、信號探針生成夾心結構；所述信號探針上包含滾環擴增引物；

(7)加入滾環擴增模板，然后滾環擴增引物與相應包含DNA酶互補序列的模板互補配對引發滾環擴增反應合成DNA酶；

(8)利用DNA酶進行催化H₂O₂-魯米諾化學發光反應系統，根據相對發光值的變化來定量檢測金黃色葡萄球菌。

在一種實施方式中，所述方法還包括先配制一定含有不同濃度的目標DNA序列的標準樣品，建立不同濃度的目標DNA序列與相對發光值的標準曲線，當檢測待測樣品時，將利用待測樣品得到的相對發光值代入到標準曲線中，即得到待測樣品中的目標DNA序列的濃度。

在一種實施方式中，所述目標DNA序列為CCT TTG ACAACT CTA GAG ATA GAG CCT TC(如SEQ ID NO:1所示)。