[發(fā)明專利]梨果實(shí)不同發(fā)育時期熒光定量內(nèi)參基因的篩選及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710415054.8
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN107190062B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 谷超;王國明;張紹鈴;郝萍萍;郭志華;金子明
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發(fā)明公開了梨果實(shí)不同發(fā)育時期熒光定量內(nèi)參基因的篩選及應(yīng)用，本發(fā)明涉及梨分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。根據(jù)多個品種梨果實(shí)動態(tài)RNA?Seq測序結(jié)果、后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及數(shù)據(jù)分析，針對性的獲得了在翠冠、豐水和雪青梨果實(shí)不同發(fā)育時期中比常用的管家基因更為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，最大程度地減小了由于內(nèi)參基因的選擇造成樣品之間和樣品內(nèi)部的差異，能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)基因表達(dá)水平的校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以達(dá)到對梨果實(shí)功能基因表達(dá)的精確定量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及梨果實(shí)發(fā)育過程中實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參基 因的篩選及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

梨(Pyrus)是我國的主栽果樹之一，栽培歷史悠久，栽培區(qū)域涵蓋全國各地，栽培面積 和產(chǎn)量一直居世界首位。近年來，我國科研工作者圍繞梨從分子生物學(xué)層面開展了眾多研 究，尤其2012年5月世界首個梨全基因組測序、組裝和基因注釋工作完成后，基因表達(dá)分 析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于揭示梨果實(shí)基因調(diào)控機(jī)理的研究中。

實(shí)時熒光定量PCR具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)和高通量等特點(diǎn)，目前廣泛地應(yīng) 用于農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等眾多研究領(lǐng)域。然而，RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量、反轉(zhuǎn)錄效率的差異等因素都會對目的基因表達(dá)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，因此要精確判斷特定靶基因表達(dá) 的水平，需要選擇合適的內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，減小檢測樣本 本身對定量結(jié)果的影響。這也進(jìn)一步說明合適的內(nèi)參基因是精確分析qRT-PCR結(jié)果的重要 前提，篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因在基因表達(dá)分析中起著關(guān)鍵的作用。

理想的內(nèi)參基因應(yīng)該是不受生長階段，組織器官，以及實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件的影響。然而，大 量的研究結(jié)果表明，并沒有這樣理想的穩(wěn)定基因。梨樹中常用的傳統(tǒng)看家基因有肌動蛋白基 因Actin、微管蛋白基因β-Tubulin、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因EF-1α、多聚泛素蛋白基因Ubiquitin 等，這些基因表達(dá)較為穩(wěn)定，本身拷貝數(shù)高，在不同器官、組織或者細(xì)胞中組成型表達(dá)，具 有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，表達(dá)水平能夠保持一致。但是越來越多的報道指出，在不同的生長階段或 者實(shí)驗(yàn)條件下，傳統(tǒng)的管家基因作為內(nèi)參基因熒光定量PCR的結(jié)果迥異，并不能夠穩(wěn)定表 達(dá)，有時會導(dǎo)致結(jié)論相反，不能真實(shí)的反映出基因的表達(dá)水平。隨著RNA-Seq技術(shù)的快速 發(fā)展，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮徒M織器官，篩選鑒定開發(fā)出新的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是解決傳統(tǒng)看家 基因弊端的有效途徑。

本發(fā)明基于RNA-Seq比較基因表達(dá)差異以篩選梨果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因的研究過程，從中挖 掘表達(dá)量較高并且表達(dá)穩(wěn)定的基因作為梨果實(shí)候選內(nèi)參基因，并通過具體的試驗(yàn)驗(yàn)證，以及 利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ReFinder 4種軟件從不同統(tǒng)計(jì)學(xué)角度分析驗(yàn) 證候選內(nèi)參基因在果實(shí)的整個發(fā)育階段中的表達(dá)穩(wěn)定性。本發(fā)明成功發(fā)現(xiàn)了梨果實(shí)發(fā)育過程 中穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并對后期通過qRT-PCR探索梨果實(shí)關(guān)鍵基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

1、要解決的技術(shù)問題

為梨果實(shí)發(fā)育過程中相關(guān)基因表達(dá)分析提供更可靠的內(nèi)參基因，以克服上述背景技術(shù)中 傳統(tǒng)看家基因的缺點(diǎn)和不足，更精確的驗(yàn)證基因表達(dá)水平，為挖掘梨果實(shí)發(fā)育中的有意義的 基因奠定基礎(chǔ)。

2、技術(shù)方案

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

梨果實(shí)不同發(fā)育時期熒光定量內(nèi)參基因，包含以下(1)～(3)中的至少一種：

(1)翠冠梨果實(shí)不同發(fā)育時期熒光定量內(nèi)參基因?yàn)镻br028511，該內(nèi)參基因Pbr028511 的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)豐水梨果實(shí)不同發(fā)育時期熒光定量內(nèi)參基因?yàn)镻br038418，該內(nèi)參基因Pbr038418 的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)雪青梨果實(shí)不同發(fā)育時期熒光定量內(nèi)參基因?yàn)镻br041114，該內(nèi)參基因Pbr041114 的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。