[發明專利]7β-羥基甾醇脫氫酶突變體及其在熊脫氧膽酸合成中的應用

有效

• 申請號: 201710413074.1
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN107099516B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 李春秀;鄭明敏;潘江;許建和;錢小龍
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;蘇州百福安酶技術有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12P33/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種活性及穩定性提高的7β-羥基甾醇脫氫酶，其特征在于，其是將如序列表中SEQID No.2所示氨基酸序列的蛋白質的第57位甘氨酸、第128位甘氨酸、第163位異亮氨酸、第172位丙氨酸、第176位絲氨酸、第197位天冬酰胺、第200位甘氨酸、第243位天冬酰胺或第258位甘氨酸中的一個或多個氨基酸殘基替換為其他氨基酸殘基形成的新氨基酸序列的衍生蛋白質。

2.根據權利要求1所述的7β-羥基甾醇脫氫酶，其特征在于，所述7β-羥基甾醇脫氫酶具有如下序列：

(1)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替換為蘇氨酸，第128位甘氨酸替換為丙氨酸，同時第200位甘氨酸替換為天冬酰胺；

(2)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替換為蘇氨酸，第176位絲氨酸替換為丙氨酸，第258位甘氨酸替換為丙氨酸；

(3)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替換為蘇氨酸，第172位丙氨酸替換為亮氨酸；

(4)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第128位甘氨酸替換為甲硫氨酸，第163位異亮氨酸替換為纈氨酸；

(5)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第163位異亮氨酸替換為纈氨酸，第172位丙氨酸替換為異亮氨酸，第243位天冬酰胺替換為色氨酸；

(6)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第128位甘氨酸替換為甲硫氨酸，第197位天冬酰胺替換為蘇氨酸，第258位甘氨酸替換為蘇氨酸；

(7)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第172位丙氨酸替換為異亮氨酸，第197位天冬酰胺替換為酪氨酸；

(8)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第176位絲氨酸替換為亮氨酸，第200位甘氨酸替換為谷氨酸，第243位天冬酰胺替換為亮氨酸；

(9)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第197位天冬酰胺替換為酪氨酸，第258位甘氨酸替換為丙氨酸；

(10)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替換為蘇氨酸，第176位絲氨酸替換為丙氨酸，第128位甘氨酸替換為甲硫氨酸，第197位天冬酰胺替換為蘇氨酸，同時第258位甘氨酸替換為蘇氨酸；

(11)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替換為蘇氨酸，第128位甘氨酸替換為丙氨酸，第172位丙氨酸替換為異亮氨酸，第197位天冬酰胺替換為酪氨酸，同時第200位甘氨酸替換為天冬酰胺；

(12)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第163位異亮氨酸替換為纈氨酸，第172位丙氨酸替換為異亮氨酸，第197位天冬酰胺替換為酪氨酸，第243位天冬酰胺替換為色氨酸。

3.一種分離的核酸，其特征在于，所述的核酸編碼如權利要求1或2中任一項所述的7β-羥基甾醇脫氫酶。

4.一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含如權利要求3所述的核酸。

5.一種重組表達轉化體，其特征在于，所述重組表達轉化體包含如權利要求4所述的重組表達載體。

6.如權利要求5所述的重組表達轉化體，其特征在于，所述重組表達轉化體的宿主選擇大腸桿菌或畢赤酵母。

7.一種重組7β-羥基甾醇脫氫酶催化劑，其特征在于，所述的重組7β-羥基甾醇脫氫酶催化劑是以下形式中的任意一種：

(1)培養如權利要求6所述的重組表達轉化體，分離含有所述7β-羥基甾醇脫氫酶的轉化體細胞；

(2)培養如權利要求6所述的重組表達轉化體，分離含有所述7β-羥基甾醇脫氫酶的粗酶液；

(3)對所述7β-羥基甾醇脫氫酶進行固定化，制備的固定化7β-羥基甾醇脫氫酶。

8.一種酶法轉化制備熊脫氧膽酸的方法，其特征在于，使用如權利要求7所述的重組7β-羥基甾醇脫氫酶催化劑催化7-羰基石膽酸的不對稱還原反應，制備熊脫氧膽酸。