[發(fā)明專利]一種提高牛類胚胎干細(xì)胞形成效率及陽性克隆比例的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710412108.5
• 申請(qǐng)日: 2017-06-02
• 公開（公告）號(hào): CN107227292A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙學(xué)明;朱化彬;崔莉莎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.褪黑素在提高牛類胚胎干細(xì)胞形成效率及陽性克隆比例中的應(yīng)用。

2.一種提高牛類胚胎干細(xì)胞形成效率及陽性克隆比例的方法，其特征在于，在牛體外受精胚胎培養(yǎng)液以及干細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10^-11-10^-7M褪黑素。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在牛體外受精胚胎培養(yǎng)液以及干細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10^-9M褪黑素。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液為含10％FBS的CR1a培養(yǎng)液，所述干細(xì)胞培養(yǎng)液為2i/LIF培養(yǎng)液。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)卵母細(xì)胞的收集和體外成熟

從牛卵巢采集直徑2-8mm卵泡中卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體COCs，選擇含有3層及以上顆粒細(xì)胞的COCs，用成熟液洗滌3遍后，按50枚COCs/每孔/500μL成熟培養(yǎng)液放入預(yù)平衡2h的四孔板中，于培養(yǎng)箱內(nèi)在38.5℃、5％CO₂和飽和濕度的條件下培養(yǎng)；

其中，所述成熟液配方：TCM199+10μg·mL^-1卵泡刺激素+10μg·mL^-1·黃體生成素·+10μg·mL^-1雌二醇+10％FBS；

2)體外受精胚胎的生產(chǎn)

COCs體外培養(yǎng)22～24h后，用含有0.1％透明質(zhì)酸酶的TCM199消化2～3min去除顆粒細(xì)胞，挑選具有第一極體且胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精；將牛冷凍細(xì)管精液于37℃水浴解凍后，用7ml洗精液、500g離心兩次，每次5min，精子沉淀用受精液調(diào)整精子密度為5×10⁶個(gè)/ml；吸取20μl精液加入含有20枚卵母細(xì)胞的80μl受精液小滴中，于38.5℃、5％CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精18-20h；將受精后的卵母細(xì)胞移入含有褪黑素的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)小滴中培養(yǎng)，間隔48h半量換液，受精卵體外培養(yǎng)7d后發(fā)育到囊胚階段；

其中，所述洗精液為含有2.5mM咖啡因的BO液；所述受精液配方：BO液+20mg/ml BSA +20μg/ml肝素鈉+100IU/ml青霉素鉀+100μg/ml鏈霉素；所述含有褪黑素的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液配方：CR1a培養(yǎng)液+10％FBS+10^-11～10^-7M褪黑素；

3)囊胚的接種

提前0.5h將培養(yǎng)小滴更換為含有褪黑素的干細(xì)胞培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)7d的囊胚接種到飼養(yǎng)層上；置于培養(yǎng)箱內(nèi)，在38.5℃、5％CO₂和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，隔天半量更換培養(yǎng)液，待貼壁后可全量換液；

其中，使用的飼養(yǎng)層為經(jīng)10μg·mL^-1絲裂霉素C處理2～3h的第2代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞；所述含有褪黑素的干細(xì)胞培養(yǎng)液配方：2i/LIF培養(yǎng)液+10^-11～10^-7M褪黑素；

4)胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM的分離與傳代培養(yǎng)

囊胚培養(yǎng)7～10d后用機(jī)械分離法進(jìn)行第1次傳代，具體用注射器的針頭將ICM形成的細(xì)胞團(tuán)塊挑出，并分離成較小的細(xì)胞團(tuán)塊，轉(zhuǎn)移至新的含有褪黑素的干細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；然后每隔5～7d進(jìn)行傳代，傳至第10代；

5)進(jìn)行AP染色，并在顯微鏡下觀察牛類胚胎干細(xì)胞陽性克隆數(shù)。

6.一種牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中含有10^-11～10^-7M的褪黑素。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液配方為：CR1a培養(yǎng)液+10％FBS+10^-11～10^-7M褪黑素；優(yōu)選CR1a培養(yǎng)液+10％FBS+10^-9M褪黑素。

8.一種牛類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中含有10^-11～10^-7M的褪黑素。