[發明專利]一種基于熒光染色觀察的農藥降解菌活性檢測方法

有效

• 申請號: 201710411999.2
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN107219205B
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 陳娟;王超;王沛芳;侯俊
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 沈根水

1.基于熒光染色觀察的有機農藥降解菌活性檢測方法，其特征是包括以下步驟：

（1）針對降解菌進行擴大培養；

（2）配置n組含不同活菌死菌比例的培養體系；

（3）計算活菌熒光和死菌熒光比值；

（4）通過降解實驗測定n組菌液的農藥降解活性；

（5）繪制熒光比值與降解活性的相關性曲線，建立降解菌活性計算公式；

（6）用未知活性菌液驗證公式準確性后用于后續測試；

所述步驟（1）針對降解菌進行擴大培養：針對某種降解菌，準備相應培養基，培養基滅菌后，接種降解菌進行擴大培養，利用分光光度計設置波長OD600檢測培養過程降解菌的生長情況；

所述步驟（2）配置n組含不同活菌死菌比例的培養體系：在降解菌生長達到穩定期后，取兩份等量的菌液，其中一份進行高溫滅活，將搖勻后的活菌液與滅活菌液以不同比例配比，形成n組培養體系，各培養體系中的活菌占總菌的百分比在0%-100%間均勻分布，為確保方法準確性，每組至少三個重復，所述n≥6；

所述步驟（3）計算活菌熒光和死菌熒光比值：培養體系配置結束后，搖勻并立即取少量不同培養體系中的菌液，菌液經熒光染料染色后在熒光顯微鏡下鏡檢，所用熒光染料能夠區分活菌和死菌，在不同激發波長下，染色后的活菌和死菌的熒光顯色不同，拍照后利用圖像處理軟件分析視野中不同熒光光密度值，代表不同培養體系中活菌和死菌熒光強度比值；

所述步驟（4）通過降解實驗測定n組菌液的農藥降解活性：首次鏡檢后，向各培養體系中加入同樣濃度的有機農藥作為降解菌的底物，分時段取樣分析各培養體系中農藥殘留量，在活菌占100%的培養組的有機農藥殘留量小于30%時終止降解實驗，分析各培養體系中的的農藥降解率；

所述步驟（5）繪制熒光比值與降解活性的相關性曲線，建立降解菌活性計算公式：以n組培養體系中活菌和死菌熒光強度比值為橫坐標，對應各組的農藥降解率為縱坐標，熒光強度和農藥降解率均為同組三個重復的平均值，選擇合適的曲線對二維平面中數據點進行擬合，繪制降解菌活性測試標準曲線，建立降解菌活性計算公式；

所述步驟（6）中用未知活性菌液驗證公式準確性：對于繪制的降解菌活性測試標準曲線的準確性進行驗證，驗證方法為對未知活菌百分比的培養液取樣進行熒光染色觀察，同時測試培養液中降解菌的活性，通過比較降解菌活性測試標準曲線計算的降解菌活性與實際測得的活性，驗證降解菌活性測試標準曲線的準確性。