[發(fā)明專利]還原性釋放糖蛋白N-糖鏈及其衍生物分離和分析鑒定的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710409524.X
• 申請日: 2017-06-02
• 公開（公告）號: CN107389805B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王仲孚;王承健;強(qiáng)珊;黃琳娟
• 申請（專利權(quán)）人: 西北大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N27/62
• 代理公司: 西安智萃知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 61221
• 代理人: 李炳輝

1.一種還原性釋放糖蛋白N-糖鏈的方法，其包括以下步驟：

(1)取糖蛋白樣品，溶于濃氨水中，糖蛋白樣品在氨水中的濃度為5～20mg/mL；

(2)向反應(yīng)體系中加入NaBH₃CN固體至反應(yīng)體系中NaBH₃CN的濃度為1mol/L，得到的混合物在40℃下反應(yīng)16小時；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮反應(yīng)體系，加水重新溶解后，調(diào)節(jié)pH至中性，再次濃縮除去溶劑，即得糖蛋白N-糖鏈粗品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的還原性釋放糖蛋白N-糖鏈的方法，其特征在于，當(dāng)所述糖蛋白樣品中的糖鏈?zhǔn)侵行訬-糖鏈時，所述步驟(2)中，在加入NaBH₃CN固體時，還向反應(yīng)體系中加入NaOH固體至反應(yīng)體系中NaOH的濃度為0.3mol/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的還原性釋放糖蛋白N-糖鏈的方法，其特征在于，制備得到糖蛋白N-糖鏈粗品后，還包括步驟(4)純化：將步驟(3)得到的N-糖鏈粗品依次經(jīng)C18固相萃取柱純化和石墨碳固相萃取柱純化，以除去肽雜質(zhì)和鹽得到純化后的N-糖鏈樣品。

4.根據(jù)權(quán)利要求3的所述的還原性釋放糖蛋白N-糖鏈的方法，其特征在于，在經(jīng)C18固相萃取柱純化前，先經(jīng)過微晶纖維素柱純化，所述微晶纖維素柱純化過程為：微晶纖維素柱預(yù)先用雙蒸水洗柱，然后用正丁醇/甲醇/水溶液(v/v/v)＝4:1:1的混合溶劑平衡；將N-糖鏈粗品重溶于正丁醇/甲醇/水(v/v/v)＝4:1:1的混合溶劑中，上樣，再用相同比例的混合溶劑沖柱，以除去肽雜質(zhì)，然后用雙蒸水將N-糖鏈洗脫出柱，收集洗脫液，減壓濃縮。

5.根據(jù)權(quán)利要求3的所述的還原性釋放糖蛋白N-糖鏈的方法，其特征在于，所述C18固相萃取柱純化過程為：C18固相萃取柱先用乙腈活化，再雙蒸水平衡，然后將待純化樣品用雙蒸水溶解后上樣，直接用雙蒸水洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮；

所述石墨碳固相萃取柱純化過程為：石墨碳固相萃取柱先用乙腈活化，再用雙蒸水平衡，然后將經(jīng)C18固相萃取柱純化后的樣品上樣，上樣后先用雙蒸水洗脫除鹽，然后，用合適濃度的乙腈水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得純化后的N-糖鏈樣品。

6.根據(jù)權(quán)利要求5的所述的還原性釋放糖蛋白N-糖鏈的方法，其特征在于，所述石墨碳固相萃取柱純化過程中，若待純化N-糖鏈?zhǔn)撬嵝訬-糖鏈，則在洗脫液乙腈水溶液中加入適量三氟乙酸，調(diào)節(jié)pH后，再進(jìn)行洗脫。

7.一種權(quán)利要求1～6任一項的方法制備得到的N-糖鏈的衍生化方法，其包括以下步驟：

(A)將N-糖鏈樣品溶于雙蒸水中，再依次加入與溶劑雙蒸水等體積的、濃度為50mg/mL NaHCO₃水溶液、雙蒸水和濃度為20mg/mL的Fmoc-Cl的四氫呋喃溶液；

(B)振蕩或攪拌反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，用乙酸乙酯萃取，以除去過量的Fmoc-Cl試劑，收集萃取后的水相；

(C)過C18固相萃取柱除鹽，C18固相萃取柱先用乙腈活化，再用雙蒸水平衡，然后將步驟(B)所得產(chǎn)物上樣，上樣后先用雙蒸水洗脫除鹽，然后，用50％的乙腈水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得Fmoc標(biāo)記的N-糖鏈衍生物。