[發(fā)明專利]一種葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710409350.7
• 申請(qǐng)日: 2017-06-02
• 公開（公告）號(hào): CN107012130B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚斌;涂濤;羅會(huì)穎;黃火清;蘇小運(yùn);柏映國;王苑;王亞茹;孟昆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京法信智言知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11737
• 代理人: 劉靜榮

本發(fā)明公開了一種葡萄糖氧化酶突變體GOD2及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的葡萄糖氧化酶GOD2突變體以來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶GODA作為母本，經(jīng)三個(gè)點(diǎn)突變Asn159Asp/Ala160Pro/Val418Glu而獲得。本發(fā)明提供的突變酶酶活力由野生型的228.0U/mg提高到了273.7U/mg，提高幅度為20％；在60℃下處理30min后，GODA的剩余酶活為130.8U/mg，GOD2的剩余酶活為180.5U/mg，提高幅度為40％；因此，本發(fā)明提供的葡萄糖氧化酶突變體GOD2能很好的滿足食品、醫(yī)藥、飼料以及紡織工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的需求，有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一種需氧脫氫酶，EC號(hào)為1.1.3.4。它能夠在有氧條件下高度專一的將β-d-葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫，因此又稱為β-D-葡萄糖氧化還原酶。目前市面上大多數(shù)的GOD都是由備受關(guān)注的畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。工業(yè)化生產(chǎn)GOD的菌株主要來源于黑曲霉和青霉。相對(duì)而言，黑曲霉產(chǎn)的GOD熱穩(wěn)定性較好，而青霉產(chǎn)的GOD酶活較高。GOD作為食品行業(yè)中一種重要的工業(yè)用酶，廣泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脫氧、面粉改良、食品褐變預(yù)防等方面，在醫(yī)藥行業(yè)中人體生化指標(biāo)葡萄糖的定量測定以及飼料行業(yè)中為益生菌提供厭氧環(huán)境等方面也有大量的應(yīng)用。

為了滿足特點(diǎn)行業(yè)對(duì)GOD的應(yīng)用需求，即獲得具有穩(wěn)定性好、活力高等特點(diǎn)的GOD，目前的普遍手段是挖掘新穎的基因資源、蛋白質(zhì)工程和優(yōu)化應(yīng)用環(huán)境等。利用蛋白質(zhì)工程的手段對(duì)GOD進(jìn)行分子改良以提高其催化性能研究更是取得了快速發(fā)展。例如，經(jīng)過定點(diǎn)突變的手段研究了GOD的三個(gè)催化殘基，即第412位的谷氨酸、第516和559位的組氨酸。統(tǒng)計(jì)目前關(guān)于酶穩(wěn)定性改良研究方面的報(bào)道論文，關(guān)于蛋白表面靜電相互作用、B-factor值、輸水相互作用、氫鍵、鹽鍵、陽離子-π相互作用、二硫鍵等理性設(shè)計(jì)策略被廣泛應(yīng)用在對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改良中。但是，以上提到的策略中，絕大多數(shù)都是以損失酶催化活力為代價(jià)來提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的。因此，探究一種既能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定，又不損失酶活的蛋白質(zhì)改造策略是非常有意義的。本發(fā)明嘗試在不損失酶活的前提下改良GOD的熱穩(wěn)定性，具有重要的理論研究意義和應(yīng)用意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白，以來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶GODA作為母本，經(jīng)三個(gè)點(diǎn)突變Asn159Asp/Ala160Pro/Val418Glu，而獲得的葡萄糖氧化酶GOD2突變體，本發(fā)明所述蛋白是如下1)、2)、或3)所述的蛋白：

1)具有序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；

2)將序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列中的第159位天冬氨酸、第160位脯氨酸、和/或第418位谷氨酸保留不變且將序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加由1)衍生的蛋白質(zhì)；

3)將序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且酶活和熱穩(wěn)定性均較野生型酶增強(qiáng)了的由1)和/或2)衍生的蛋白質(zhì)。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由581個(gè)氨基酸殘基組成。

上述1)、2)、或3)所述的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行重組異源表達(dá)得到。上述1)、2)、或3)所述的蛋白的編碼基因可通過將序列表中SEQ ID №.1所示DNA序列缺失一個(gè)或幾個(gè)編碼氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變后得到。

編碼所述蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。