[發(fā)明專利]一種基于發(fā)光細(xì)菌法的土壤綜合毒性檢測方法

在審

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• 申請日: 2017-06-02
• 公開（公告）號(hào): CN107238599A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪陵成;王麗平;陳廣姣
• 申請（專利權(quán)）人: 河海大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/76
• 分類號(hào): G01N21/76;G01N1/28;G01N1/38;G01N1/40
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司32200
• 代理人: 樓高潮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)光細(xì)菌的綜合毒性檢測方法領(lǐng)域，具體涉及一種基于發(fā)光細(xì)菌法的土壤綜合毒性檢測方法。

背景技術(shù)

土壤作為人類賴以生存的場所，含有多種污染物，如持久性有機(jī)污染物與農(nóng)藥、揮發(fā)性有機(jī)物和多環(huán)芳烴類有機(jī)物等。每種污染物不僅有各自的毒性，而且各種污染物質(zhì)混合、相互作用也會(huì)產(chǎn)生潛在的毒性。現(xiàn)有檢測技術(shù)多局限于檢測單一污染物毒性，無法測定污染物的復(fù)合污染效應(yīng)。因此，開展土壤的綜合毒性檢測工作有重要意義。

我國是農(nóng)業(yè)大國，建立準(zhǔn)確可靠、靈敏度高和符合國際標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)田土壤污染物檢測技術(shù)，從整體上提高我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境中污染物綜合毒性檢測能力，為我國農(nóng)產(chǎn)品的種植以及農(nóng)田土壤的修復(fù)提供重要的理論依據(jù)以及指導(dǎo)意見，保證農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全和避免國際間的貿(mào)易爭端，具有非常重要的理論和實(shí)踐意義。

現(xiàn)有檢測土壤毒性的技術(shù)可以分為定量檢測技術(shù)和綜合毒性快速檢測技術(shù)。這些方法都可以檢測土壤綜合毒性，有些方法通過同時(shí)檢測土壤中多種農(nóng)藥、重金屬等的含量反映土壤綜合毒性，如色譜類技術(shù)、化學(xué)發(fā)光法、比色法、免疫色譜法等；有些則通過多種農(nóng)藥、重金屬等的聯(lián)合作用效果反映飲用水綜合毒性，如微生物法和酶法。目前，有機(jī)磷農(nóng)藥的定量檢測技術(shù)主要是色譜類技術(shù)，包括氣相色譜法液相色譜法、超臨界流體色譜法等。重金屬定量檢測技術(shù)包括紫外可見分光光度法、原子吸收光譜法、原子熒光光度法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等。以上這些方法都需要昂貴的檢測儀器和復(fù)雜的前處理，并且由于儀器測定條件變化與檢測結(jié)果密切相關(guān)，需要非常專業(yè)的分析測試人員操作。因此，只有專業(yè)分析測試機(jī)構(gòu)和研究機(jī)構(gòu)的中心實(shí)驗(yàn)室才具備測試條件，檢測樣品的周期相對較長，檢測過程復(fù)雜，檢測成本較高，不適合抽檢實(shí)踐中快速和簡便的需要。

發(fā)明內(nèi)容

解決的技術(shù)問題：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在操作復(fù)雜、時(shí)間長、檢測成本較高，并且局限于檢測單一污染物毒性，無法測定污染物的復(fù)合污染效應(yīng)等問題，本發(fā)明提供一種基于發(fā)光細(xì)菌法的土壤綜合毒性檢測方法，通過甲醇/乙二醇溶液浸提方法對土壤樣品中的非水溶性有毒物質(zhì)進(jìn)行浸提，利用發(fā)光細(xì)菌法一明亮發(fā)光桿菌T₃對有毒有害物質(zhì)的靈敏性和較低的檢測限，建立一種簡便的土壤綜合毒性檢測方法，降低了對采樣量的要求，從而能夠開展土壤樣品進(jìn)行綜合毒性的快速檢測，測定土壤的綜合毒性水平。

技術(shù)方案：一種基于發(fā)光細(xì)菌法的土壤綜合毒性檢測方法，所述方法包括以下步驟：

步驟一.對土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理：在待檢測土壤區(qū)域中采用隨機(jī)多點(diǎn)取樣法選取采樣點(diǎn)，采集耕層土壤內(nèi)的土樣后，將土樣混合均勻，置于土壤袋后在室溫下陰涼處風(fēng)干，去除植物殘根，磨碎后于室溫避光保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二.樣品的浸提：稱取步驟一制備的土樣，過尼龍篩后用甲醇索氏提取，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入乙二醇后將該混合物繼續(xù)濃縮備用；

步驟三.浸提液的毒性檢測：取培養(yǎng)后的發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液，加入步驟二制備的樣品浸提液、15wt.％NaCl溶液和純凈水，混勻后靜置，測定發(fā)光強(qiáng)度；

步驟四.樣品毒性的表達(dá)：測量步驟三靜置后混合液的發(fā)光抑制率、氯化汞當(dāng)量濃度。

作為優(yōu)選，所述步驟一選取5個(gè)采樣點(diǎn)。

作為優(yōu)選，所述步驟二中稱取3～5g步驟一制備的土樣，過2mm尼龍篩后用甲醇索氏提取16h，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5mL，加入3～5mL乙二醇，然后將混合物繼續(xù)濃縮至5mL備用。

作為優(yōu)選，所述步驟三中發(fā)光細(xì)菌為明亮發(fā)光桿菌T₃。

作為優(yōu)選，所述步驟三培養(yǎng)后的發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液、樣品浸提液、15wt.％NaCl溶液和純凈水的體積比為1：2：4：13。

作為優(yōu)選，所述步驟三取50μL培養(yǎng)后的發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液，加入100μL樣品浸提液、200μL 15wt.％NaCl和650μL純凈水。

作為優(yōu)選，所述步驟三中培養(yǎng)后的發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液的制備過程如下：取培養(yǎng)基含酵母浸出液0.5g、胰蛋白胨0.5g、甘油0.3g、NaCl 3g、Na₂HPO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 0.5g和蒸餾水100mL混合均勻，調(diào)節(jié)p H值至6.5～7.0；第一代斜面菌種在20℃溫度下培養(yǎng)24h后，立即接入第二代斜面培養(yǎng)12h后備用；將上述菌齡滿12h的新鮮斜面菌體接入盛有50mL培養(yǎng)液的三角瓶中，接種量不超過1環(huán)，20℃、210r/min振蕩培養(yǎng)，每2h測定1次培養(yǎng)液發(fā)光強(qiáng)度。

作為優(yōu)選，所述步驟三中取培養(yǎng)16～18h后的發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液。