[發明專利]一種水體微生物污染來源定量解析方法

有效

• 申請號: 201710406714.6
• 申請日: 2017-06-02
• 公開（公告）號: CN107058580B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 吳仁人;周偉堅;張楊;汪光
• 申請（專利權）人: 環境保護部華南環境科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/06;C12R1/01
• 代理公司: 北京迎碩知識產權代理事務所(普通合伙) 11512
• 代理人: 錢揚保;張群峰

1.一種適用于中國珠三角地區水體微生物污染來源定量解析方法，包括以下步驟：

(1)引物區域性驗證：

在區域目標水域周邊采集不同生物的糞便樣品，樣品采集后保存于冰盒中，送回實驗室進行后續處理；

采用糞便基因組DNA提取試劑盒通過懸浮、破碎、吸附柱純化步驟從糞便樣品中提取基因組DNA，置于冰箱低溫儲存；

以各生物糞便中提取的基因組DNA為模板，選取已有的各生物擬桿菌特異性引物分別進行qPCR擴增，分析引物的靈敏度與特異性；選取靈敏度和特異性較高的引物作為區域特異性引物；引物的靈敏度與特異性判定依據為：將Cq＝32.0所對應的拷貝數作為最低定量限來驗證引物的特性，當引物擴增的Cq<32.0且熔解曲線呈現單一的熔解峰時判定為陽性結果，而Cq≥32.0時判定為陰性結果；選取靈敏度和特異性都在85％以上的引物作為區域特異性引物；

篩選出的區域特異性引物為：人源特異性引物qHS601F/qBac725R、反芻動物特異性引物BacB2-590F/Bac708Rm、豬源特異性引物Bac41F/Bac163R及雞源特異性引物qC160F-HU/qBac265R-HU；

其中，引物qHS601F/qBac725R的序列為：

GTTGTGAAAGTTTGCGGCTCA/CAATCGGAGTTCTTCGTGATATCTA，

引物BacB2-590F/Bac708Rm的序列為：

ACAGCCCGCGATTGATACTGGTAA/CAATCGGAGTTCTTCGTGAT,

引物Bac41F/Bac163R的序列為：

GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT/ACCTCATACGGTATTAATCCGC,

引物qC160F-HU/qBac265R-HU的序列為：

AAGGGAGATTAATACCCGATGATG/CCGTTACCCCGCCTACTAC；

(2)標準曲線制作：

以區域特異性引物對提取的基因組DNA進行PCR擴增，對擴增后的目標產物進行純化回收，連接到pMD 19-T Vector載體上，轉化DH5α感受態細胞，采用含有氨芐抗生素的平板培養基挑取陽性克隆，提取質粒DNA，測定其濃度；

將質粒梯度稀釋，并以此為模板，進行qPCR擴增；反應結束之后，進行標準曲線的制作；標準曲線的判定依據為：標準曲線的相關系數(R²)大于0.99，結果可信；擴增效率(E)是通過標準曲線斜率來確定的，兩者符合公式E＝10^(-1/Slope)-1；如果一個反應的標準曲線斜率為-3.32，則該反應的擴增效率E＝100％，擴增效率(E)在90％～110％之間是可接受的；

(3)污染源解析：

從區域目標水域進行水樣品采集，所有樣品采集后進行編號并保存于冰盒中，在實驗室中提取水樣品中的基因組DNA；采用區域特異性引物進行qPCR擴增，結果經標準曲線公式進行計算，得出目標水域中各微生物的濃度值，根據各微生物的濃度值來解析區域目標水域的污染源；

其中所述qPCR擴增條件：擴增體系為20μL：Premix Ex TaqTM II(2×)10μL；ddH₂O，6.4μL；上下游引物各0.8μL；DNA模板2μL；擴增程序：①預變性，95℃，30s；②變性，95℃，5s；③退火延伸，60℃，1min；40個循環。

2.根據權利要求1所述的水體微生物污染來源定量解析方法，步驟(2)中將質粒按10倍梯度稀釋，稀釋10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 7個梯度，每個梯度作為標準品設3個重復。