[發明專利]一種利用煙草質體高效生產蝦青素的方法

在審

• 申請號: 201710406641.0
• 申請日: 2017-06-02
• 公開（公告）號: CN107418968A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 拉爾夫·博克;盧穎洪;丹尼爾·卡徹;桑德拉·斯戴爾曼;斯蒂芬妮·羅夫;張江
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;C12P23/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司11401
• 代理人: 楊采良

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一種利用煙草質體高效生產蝦青素的方法。

背景技術

蝦青素(astaxanthin)是一種酮式類胡蘿卜素，即3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素，有極強的猝滅單線態氧和清除自由基能力，其抗氧化能力比維生素E強500倍。相比于其他普通的抗氧化物質而言，蝦青素可以通過血腦屏障進而發揮更好的抗氧化作用。許多研究指出，蝦青素被用來預防糖尿病、心血管疾病、神經系統疾病等，對人類和動物健康有促進作用。如今，蝦青素已被制成保健品，也可以作為食用色素，畜牧業和水產品的飼料添加劑，得到較為廣泛的應用。

雨生紅球藻中蝦青素含量為1.5％～3.0％，是目前所知的自然界中含蝦青素最多的生物。然而，雨生紅球藻生長慢，對生長環境比較敏感，不能大規模低成本養殖。雖然關于雨生紅球藻培養蝦青素以及蝦青素的不同制備方法的研究在國內已較為充分，但是還未形成規模化生產，這也造成了天然蝦青素價格高昂和供不應求。目前只有湖北荊州天然蝦青素公司初具規模，該公司是亞洲第一家從事規模化養殖雨生紅球藻生產天然蝦青素的企業。

近年來，不斷有科研人員嘗試將雨生紅球藻等微生物蝦青素合成途徑中關鍵酶基因在大腸桿菌、酵母及植物中表達，并取得了一定的成功。其中，煙草質體基因組轉化表達細菌來源的CrtW和CrtZ的煙草蝦青素含量達到5.44mg/g干重(Hasunuma et al.,Plant J 2008,55:8527-868)。番茄中共表達來源于萊茵衣藻的β-胡蘿卜素加氧酶基因(BKT)和來源于雨生紅球藻的β-胡蘿卜素羥化酶基因(BHY)，葉片中游離的蝦青素為3.12mg/g干重，果實中蝦青素脂含量為16.1mg/g干重(Huang et al.,Metab Eng 2013,17:59-67)。與煙草相比，雖然果實中蝦青素含量較高，但番茄果實較長的生長周期使其總原材料不一定占絕對優勢。

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種利用煙草質體高效生產蝦青素的方法。

一種利用煙草質體高效生產蝦青素的方法，包括以下步驟：

植物表達載體pAXT，通過合成經密碼子優化過的來自水仙(Narcissus pseudonarcissus)的番茄紅素-β-環化酶基因(NpLyc)、Brevundimonas sp.SD212菌株的β-胡蘿卜素羥化酶(BsCrtZ)基因及β-胡蘿卜素酮酶(BsCrtW)基因，共同連接到質體表達載體，組成三順反子結構，由PrrnT7g10啟動子驅動。

進一步，所述的植物表達載體pAXT是通過一下方法構建而得：

合成經密碼子優化過的源于Brevundimonas sp.strain SD212菌的BsCrtW和BsCrtZ基因的雙順反子結構，BsCrtW前融合了來自噬菌體T7的g10基因SD序列，BsCrtZ前融合人工合成SD序列(GGGAGGGATTTC)，且BsCrtW和BsCrtZ閱讀框之間用BamHI和PstI酶切位點隔開。

將帶有IEE(基因間調控元件)的煙草rps16基因的3’UTR(Nt-Trps16)，然后插入到pBluescriptKS載體的SacII/NotI位點間。然后將BsCrtW/BsCrtZ雙順反子用NotI/SalI雙酶切后插入到Nt-Trps16-IEE后面。

將帶有IEE的煙草rbcL基因的3’UTR(Nt-TrbcL)，然后用BamHI/PstI雙酶切后插入到BsCrtW后面。

將萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)rbcL基因的3’UTR(Cr-TrbcL)克隆到SalI/XhoI位點之間。

合成密碼子優化過的源于水仙花的NpLyc基因，且NpLyc前面融合了煙草核糖體RNA啟動子(Nt-Prrn)及噬菌體T7g10基因的5’UTR，然后將該片段插入到SacI/SacII位點間得到三順反子結構。

將三順反子用SacI/XhoI雙酶切后插入到pKP9載體(Zhou et al.,2008 Plant Biotechnol J6:897-913)得到pAXT載體。

應用本發明的植物表達載體pAXT建立產蝦青素轉基因植物的方法，包括構建含有NpLyc、BsCrtW和BsCrtZ的煙草質體表達載體，然后用基因槍的方法得到轉基因植株，催化植物本身的類胡蘿卜素生成蝦青素的轉基因植株步驟。