[發明專利]促進3β-HSD基因表達的表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710405615.6
• 申請日: 2017-06-01
• 公開（公告）號: CN107287241B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 徐新云;王利;毛侃瑯;彭鵬
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N7/01;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 徐春祺

1.一種組合物在制備抗腫瘤的藥物中的應用，其特征在于，所述抗腫瘤的藥物為抗乳腺癌的藥物，所述組合物包括：

促進3β-HSD基因表達的表達載體，所述促進3β-HSD基因表達的表達載體為慢病毒表達載體，所述促進3β-HSD基因表達的表達載體包括慢病毒載體pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段，所述多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，所述目的基因表達片段中含有用于表達3β-HSD的3β-HSD基因編碼序列，所述目的基因表達片段的5’端具有EcoRI酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段的3’端具有NotI酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段正向插入在所述多克隆位點序列的所述EcoRI酶切位點和所述NotI酶切位點之間，所述3β-HSD基因編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

或者，含有3β-HSD基因的慢病毒，所述含有3β-HSD基因的慢病毒通過如下方法制備得到：將促進3β-HSD基因表達的表達載體轉染進入293FT細胞中；以及對轉染后的所述293FT細胞擴增表達，獲得所述含有3β-HSD基因的慢病毒，其中，所述促進3β-HSD基因表達的表達載體包括慢病毒載體pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段，所述多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，所述目的基因表達片段中含有用于表達3β-HSD的3β-HSD基因編碼序列，所述目的基因表達片段的5’端具有EcoRI酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段的3’端具有NotI酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段正向插入在所述多克隆位點序列的所述EcoRI酶切位點和所述NotI酶切位點之間，所述3β-HSD基因編碼序列的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述EcoRI酶切位點黏性末端的3’端直接與所述3β-HSD基因編碼序列的5’端連接，所述NotI酶切位點黏性末端的5’端直接與所述3β-HSD基因編碼序列的3’端連接，所述EcoRI酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-aattc-3’，所述NotI酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-ggccgc-3’。

3.根據權利要求1或者2所述的應用，其特征在于，所述促進3β-HSD基因表達的表達載體通過如下構建方法構建得到：

以3β-HSD基因編碼序列作為擴增模板，并加入上游引物和下游引物后進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，所述上游引物包括針對所述3β-HSD基因編碼序列的5’端設計的序列和針對EcoRI酶切位點設計的序列，所述下游引物包括針對所述3β-HSD基因編碼序列的3’端設計的序列和針對NotI酶切位點設計的序列；

對所述PCR擴增產物進行加A尾反應，使得所述PCR擴增產物的兩端連接A堿基，并將加A尾反應后的所述PCR擴增產物連接到T載體中，得到重組T載體；

用限制性內切酶EcoRI和限制性內切酶NotI對所述重組T載體進行雙酶切，得到目的基因表達片段；以及

將所述目的基因表達片段連接到經過限制性內切酶EcoRI和限制性內切酶NotI雙酶切處理后的慢病毒載體pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro中，得到所述促進3β-HSD基因表達的表達載體。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述上游引物的堿基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的堿基序列如SEQ ID No.3所示。