[發明專利]促進StAR基因表達的表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710405405.7
• 申請日: 2017-06-01
• 公開（公告）號: CN107177633B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 徐新云;彭鵬;袁建輝;毛侃瑯;王利
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 鄧云鵬

本發明公開了一種促進StAR基因表達的表達載體及其構建方法和應用。該表達載體包括慢病毒載體pLVX?mCMV?ZsGreen?PGK?Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段。目的基因表達片段正向插入在EcoRI酶切位點和NotI酶切位點之間。該表達載體能夠轉染到人源細胞中，并在人源細胞中持續、穩定且高效表達StAR基因。該表達載體還能增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用，有望應用在抗腫瘤的藥物中。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種促進StAR基因表達的表達載體及其構建方法和應用。

背景技術

類固醇激素合成急性調節蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory protein，StAR)，也稱類固醇激素靈敏調節蛋白，是促進膽固醇由線粒體外膜轉入到線粒體內膜的一種轉運蛋白，在膽固醇的代謝以及類固醇激素的合成中起關鍵的限速作用。研究表明，StAR在調節睪酮的合成過程中起重要的作用，是維持正常生理功能所必須的一種重要蛋白。傳統的StAR基因表達技術中，例如任欣等利用萊克多巴胺實現對大鼠睪丸中StAR基因表達的調控，馬金魁等則研究了鹽酸克倫特羅對大鼠睪丸中StAR表達的影響。上述研究均為應用間接手段調控StAR 基因表達，目前缺乏能夠轉染到人源細胞，并在人源細胞中持續、穩定且高效表達StAR基因的表達載體。

發明內容

基于此，有必要提供一種能夠在人源細胞中持續、穩定且高效表達StAR基因的表達載體及其構建方法和應用。

一種促進StAR基因表達的表達載體，包括慢病毒載體 pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段，所述多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI 酶切位點，所述目的基因表達片段中含有用于表達StAR的StAR基因編碼序列，所述目的基因表達片段的5’端具有EcoRI酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段的3’端具有NotI酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段正向插入在所述多克隆位點序列的所述EcoRI酶切位點和所述NotI酶切位點之間。

在一個實施方式中，所述StAR基因編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

在一個實施方式中，所述EcoRI酶切位點黏性末端的3’端直接與所述StAR 基因編碼序列的5’端連接，所述NotI酶切位點黏性末端的5’端直接與所述StAR 基因編碼序列的3’端連接，所述EcoRI酶切位點黏性末端的堿基序列為 5’-aattc-3’，所述NotI酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-ggccgc-3’。

一實施方式的促進StAR基因表達的表達載體的構建方法，包括以下步驟：

以StAR基因編碼序列作為擴增模板，并加入上游引物和下游引物后進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物，所述上游引物包括針對所述StAR基因編碼序列的5’端設計的序列和針對EcoRI酶切位點設計的序列，所述下游引物包括針對所述StAR基因編碼序列的3’端設計的序列和針對NotI酶切位點設計的序列；

對所述PCR擴增產物進行加A尾反應，使得所述PCR擴增產物的兩端連接A堿基，并將加A尾反應后的所述PCR擴增產物連接到T載體中，得到重組T載體；

用限制性內切酶EcoRI和限制性內切酶NotI對所述重組T載體進行雙酶切，得到目的基因表達片段；以及

將所述目的基因表達片段連接到經過限制性內切酶EcoRI和限制性內切酶 NotI雙酶切處理后的慢病毒載體pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro中，得到所述促進StAR基因表達的表達載體。

在一個實施方式中，所述StAR基因編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，所述上游引物的堿基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的堿基序列如SEQ ID No.3所示。