[發(fā)明專利]一種活性多肽SPKP?XI的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710402612.7
• 申請(qǐng)日: 2017-06-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107141343A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長(zhǎng)沙沁才生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C07K1/18;C07K1/20
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型生物活性多肽及其制備方法，具體涉及一種通過(guò)陽(yáng)離子交換HPLC以及兩步反相HPLC分離獲得新型生物活性多肽的方法。

背景技術(shù)

生物毒素是一種重要的生命現(xiàn)象，是生物界在億萬(wàn)年進(jìn)化過(guò)程中為了生存而形成的，是一個(gè)巨大的潛在發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子的重要資源。目前國(guó)際上已經(jīng)成功篩選到一些生物毒素分子用于治療某些相關(guān)疾病或作為新型藥物的設(shè)計(jì)參考。蜘蛛產(chǎn)生各種作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒素，其神經(jīng)毒素根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為蛋白多肽類神經(jīng)毒素和多胺類神經(jīng)毒素。其中蜘蛛多肽神經(jīng)毒素最重要，蜘蛛多肽類神經(jīng)毒素根據(jù)它們的功能和分子特征可分為兩種類型:第一種是低分子量多肽類，它們能與興奮性細(xì)胞膜上的陽(yáng)離子通道相互作用；第二種是高分子量多肽類，它們與突觸前膜的受體組分及增強(qiáng)神經(jīng)介質(zhì)的分泌作用密切相關(guān)。蜘蛛毒液已成為神經(jīng)毒素的一個(gè)重要新來(lái)源，而且蜘蛛毒液中特異性藥物和毒素分子也是我們尋找農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑的較好模式分子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的旨在于提供一種從廣西纓毛蛛粗毒中制備新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鉀肽-XI（SPKP-XI），其氨基酸序列為：

NH₂-Glu Cys Arg Lys Met Phe Gly Gly Cys Ser Val Asp Ser Asp Cys Cys Ala His Leu Gly Cys Lys Pro Thr Leu Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Thr Phe-NH₂

所述的蜘蛛抑鉀肽-XI的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

所述方法包括：（1）粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12 000rpm離心5 min, 上清用Millipore公司一次性過(guò)濾器(0.22 μm)過(guò)濾后，置于4°C保存。粗毒上樣陽(yáng)離子交換HPLC(ion-exchange HPLC)進(jìn)行第一步分離。采用Waters 650型HPLC、美國(guó)Pharmacia 公司的Hiprep^TM16/10 CM FF預(yù)裝柱進(jìn)行分離。486檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為 215nm。流動(dòng)相為四相洗脫系統(tǒng)，流速為1.5mL/min。洗脫液分別為A相0.1M NaH₂PO₄, B相0.1M Na₂HPO₄, C相 1M NaCl, D相ddH₂O。上述經(jīng)ion-exchange HPLC分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化。采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱 (218TP54, 4.6×250 mm) 于分析型Waters 2690 高效液相色譜儀上進(jìn)行梯度洗脫，996檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，流動(dòng)相為含0.1%TFA的水（A）和乙腈（B），洗脫速度為1mL/min，柱溫為40℃。

（2）通過(guò)上述陽(yáng)離子交換HPLC以及兩步反相HPLC共三步分離獲得的SPKP-XI，運(yùn)用質(zhì)譜鑒定純度達(dá)到98%以上，其分子量約為3726.4 Da，經(jīng)序列測(cè)定，該多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)由34個(gè)氨基酸殘基組成，其中含6個(gè)半胱氨酸并形成三對(duì)二硫鍵，C-端酰胺化。多肽SPKP-XI純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無(wú)氣味，極易溶解于水，水溶液近于無(wú)色透明。

附圖說(shuō)明

圖1是廣西纓毛蛛粗毒陽(yáng)離子交換HPLC圖譜。“*”表示目的峰，縱坐標(biāo)表示洗脫峰在280 nm的吸收值，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間。

圖2是廣西纓毛蛛粗毒目的陽(yáng)離子交換峰反相HPLC圖譜。箭頭表示目的峰，縱坐標(biāo)表示各個(gè)洗脫峰在280 nm下的吸收值，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間。

圖3是SPKP-XI的反相HPLC圖譜。

具體實(shí)施方式

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 粗毒的獲取

廣西纓毛蛛采集于海南省瓊中縣境內(nèi)的山區(qū)，粗毒毒液采于雌性蛛種。簡(jiǎn)述如下：使蜘蛛張開(kāi)螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10 V的脈沖電流刺激兩螯肢基部外側(cè)3～5 s。蜘蛛感受電刺激后，即用觸肢緊緊抱住杯壁，同時(shí)將螯爪有力刺向杯內(nèi)壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷凍干燥機(jī)中經(jīng)真空冷凍干燥成淺黃色或白色粉末即為粗毒。

1.2 SPKP-XI 的分離純化及質(zhì)譜分析