[發明專利]SPKP?XI在制備Kv4.1鉀通道抑制劑中的應用

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• 申請號: 201710402603.8
• 申請日: 2017-06-01
• 公開（公告）號: CN107158362A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 長沙沁才生物科技有限公司
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61P9/00;A61P25/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XI（簡寫為SPKP-XI）在制備電壓門控鉀通道亞型工具試劑-Kv4.1通道抑制劑中的用途。

背景技術

電壓門控鉀通道廣泛分布于神經元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結構蛋白，其參與調節神經遞質的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時也是治療藥物作用的重要靶標之一。鉀離子通道的結構與功能關系研究已經成為國際上的研究熱點。Kv4鉀通道屬于瞬時外向鉀通道，在大腦、心臟、肺和平滑肌中高表達，它是動作電位復極化早期外向電流的主要成分，在調節神經元放電頻率和心肌興奮收縮耦聯等方面起重要作用。Kv4鉀通道很可能成為神經性和心血管等疾病的重要治療靶點。很顯然，借助Kv4鉀通道的特異性調制劑對這些研究的深入開展是非常必要的。通過闡述這些特異性調制劑作用于鉀通道的分子機制，除了在理論上可深入推測Kv4鉀通道亞型之間的功能活動區別和門控活動機制外，還可以為將它們開發成治療人類相關疾病的新藥提供充分的理論基礎和廣闊的應用前景。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應用前景的工具試劑或藥物導向物質，不僅是有毒動物抵御天敵的有力武器，也是從事神經生物學和生理學研究、天然創新藥物開發以及蛋白質基礎研究的寶貴材料,同時也是研究離子通道的獨特“分子探針和解密器”。

發明內容

本發明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XI在制備電壓門控鉀通道亞型工具試劑-Kv4.1通道抑制劑的應用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XI（簡寫為SPKP-XI），其氨基酸序列為：

NH₂-Glu Cys Arg Lys Met Phe Gly Gly Cys Ser Val Asp Ser Asp Cys Cys Ala His Leu Gly Cys Lys Pro Thr Leu Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Thr Phe-NH₂，其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XI作為單一有效活性組份用于制備Kv4.1通道抑制劑。

所述的蜘蛛抑鉀肽-XI的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鉀肽-XI作為單一有效活性組分用于制備Kv4.1通道抑制劑，以細胞外給藥的方式制備成Kv4.1通道工具試劑。

蜘蛛抑鉀肽-XI在制備Kv4.1通道工具試劑或抑制劑時，配制細胞外給藥的劑量為5 μmol/L。

蜘蛛抑鉀肽-XI對Kv4.1通道的抑制呈現時間依從性和可逆性，是一種較好的Kv4.1鉀通道工具試劑。

附圖說明

圖1是SPKP-XI對表達于爪蟾卵母細胞的Kv4.1鉀通道亞型的影響。

圖2是SPKP-XI對表達于爪蟾卵母細胞的Kv1.3鉀通道亞型的影響。

具體實施方式

為了更好的理解和更充分公開本發明，下面將通過細胞外給藥途徑，采用非洲爪蟾卵母細胞模型來說明蜘蛛抑鉀肽-XI的Kv4.1通道抑制作用。

1、實驗材料和方法

1.1通道質粒的擴增和提取

采用promega公司的質粒提取試劑盒（Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification System）。

溶液的配方如下：

細胞重懸液細胞裂解液

Tris-HCl (pH 7.5) 50mMNaOH 0.2M

EDTA10mM1% SDS

RNase A 100μg/ml

中和液洗脫液

鹽酸胍4.09M 乙酸鉀 60mM

乙酸鉀0.759MTris-HCl (pH 7.5) 8.3mM

冰醋酸2.12M EDTA 0.04mM

pH為4.2 加入95% 乙醇 ,終濃度為60%乙醇

操作步驟：

? 收集菌液（4℃，12000r/min，離心 1min）

? 棄上清，用濾紙吸干殘留在管壁的溶液，加入250μL細胞重懸液，充分混勻

? 加入250μL細胞裂解液，溫和上下顛倒4次混勻，放置5min