[發(fā)明專利]一種提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710402513.9
• 申請(qǐng)日: 2017-06-01
• 公開（公告）號(hào): CN107287155A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周麗英;汪曉敏;袁衛(wèi)平;萬謙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溯源生命科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11427
• 代理人: 陳娟

1.一種提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法，其特征在于：提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法為：步驟一、脂肪干細(xì)胞獲取，1-1、將吸脂來源的脂肪組織放入預(yù)冷含1%雙抗的生理鹽水中，密封，低溫條件下,2-8℃下送回實(shí)驗(yàn)室；1-2、將上述脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積，向組織中加入等體積的消化液，所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%I型膠原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min，然后將消化好的組織靜置5min，此時(shí)液面分為3層，上層黃色油狀物是破碎的脂肪細(xì)胞釋放的脂滴，中層為大顆粒脂肪細(xì)胞層，間或混合少量纖維，下層為單個(gè)核細(xì)胞層；1-3、棄掉上層和中層細(xì)胞，將下層的細(xì)胞懸液以1500r/min，離心10min后棄上清，得到離心管底部的脂肪干細(xì)胞團(tuán)，用非動(dòng)物源血清L-DMEM培養(yǎng)液將其重懸，密度調(diào)整到1×10⁵個(gè)/mL，然后接種在培養(yǎng)面積為25cm²的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；1-4、在 37℃下5%的CO₂條件下培養(yǎng)；1-5、當(dāng)脂肪干細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后按一傳二進(jìn)行傳代，首先，用生理鹽水沖洗一遍細(xì)胞，然后加入3mL的混合酶溶液，所述的混合酶溶液由0.25%胰酶和0.04%的EDTA在體積為為1:1情況下配置而成,消化，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)生明顯的變形，縮成球狀后，立即用等體積的培養(yǎng)基中止消化，并用吸管輕輕吹打瓶底部，確保細(xì)胞完全脫落至懸液中，1000r/min，離心5min，然后，將離心得到的細(xì)胞團(tuán)重懸，調(diào)整密度后按1:2進(jìn)行接種；1-6、在37℃，5%的CO₂條件下傳代培養(yǎng)；1-7、細(xì)胞凍存，凍存細(xì)胞前在12h內(nèi)進(jìn)行換液，具體步驟與步驟1-5相同，即棄去培養(yǎng)液，生理鹽水洗一遍，加入消化液，待消化完成后，中止消化；輕輕吹打使細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，1000r/min，離心5min；棄上清，再用生理鹽水洗一遍，計(jì)數(shù)；最后加入凍存液,所述的凍存液中無血清L-DMEM培養(yǎng)液：人血白蛋白：DMSO=5:4:1，使得細(xì)胞密度為1×10⁶個(gè)/mL左右；分裝至2mL凍存管中，每管1mL-1.5mL；將凍存管放入程序降溫盒內(nèi)，然后放入-80℃冰箱過夜，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)長(zhǎng)期儲(chǔ)存；1-8、細(xì)胞復(fù)蘇，從液氮中迅速取出凍存管，立即放入37℃恒溫水浴鍋中，并不斷晃動(dòng)，使其完全溶化；無菌條件下，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含5mL無血清L-DMEM培養(yǎng)液離心管中，在1000r/min情況下，離心5min，棄上清；重復(fù)洗一遍；加入適量非動(dòng)物源血清L-DMEM培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中；37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)，待用；

步驟二、脂肪細(xì)胞獲取，2-1、將吸脂來源的脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積；2-2、向組織中加入等體積的消化液,所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%的I型膠原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min，然后將消化好的組織靜置5min，待其分層后，用吸管吸取位于懸液中層的脂肪細(xì)胞，用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，并將過濾后的細(xì)胞懸液以1000r/min，離心2min后棄掉下層懸液得到脂肪細(xì)胞；2-3、用生理鹽水懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)；步驟三、移植，3-1、在處理脂肪細(xì)胞的同時(shí)收獲培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，計(jì)數(shù)；3-2 、將脂肪干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞按2:1比例進(jìn)行混合；3-3 、將步驟3-2中得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行移植到相應(yīng)部位。