[發明專利]一種造血干細胞凍存液及造血干細胞凍存方法

在審

• 申請號: 201710401480.6
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN107094753A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 羅天恩
• 申請（專利權）人: 東莞市保萊生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司44215
• 代理人: 姜華

技術領域

本發明涉及細胞生物學技術領域，具體涉及一種造血干細胞凍存液及造血干細胞凍存方法。

背景技術

造血干細胞是血液系統中的成體干細胞，是一個異質性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細胞的潛能。它是研究歷史最長且最為深入的一類成體干細胞，對研究各類干細胞，包括腫瘤干細胞，具有重要指導意義。血液系統中的成熟細胞壽命極短，因此在人的一生中，造血干細胞需要根據機體的生理需求適時的補充血液系統各個成熟細胞組分。同時在損傷、炎癥等應激狀態下，造血干細胞也扮演著調節和維持體內血液系統各個細胞組分的生理平衡的角色。

造血干細胞在臨床上應用極為廣泛，造血干細胞凍存是保證造血干細胞移植成功的關鍵技術之一，故其凍存方式尤為重要。目前臨床造血干細胞凍存有-196℃液氮程控降溫保存和-80℃非程控降溫保存，前者能長期保存且細胞損傷少，一般可保存23～25年，但操作復雜、設備昂貴，解凍后有細胞凝集現象，后者可保存干細胞1～2年，其操作相對簡便、費用低，但保存細胞時間及細胞活性受限。

探索一種操作簡便、快速、成本低廉及保存時間更長的干細胞凍存方法，對于臨床造血干細胞的儲存、應用及造血干細胞移植成功具有重要意義。在造血干細胞的凍存中，使用的凍存劑及方法均非常重要。目前應用于-80℃低溫保存干細胞的保護劑有二甲基亞砜、CP-1、羥乙基淀粉、RPMI1640培養基、人血白蛋白等，不同的保護劑的配方及使用方法差異較大，對干細胞的保存效果與保存時間也存在差異，多數保存細胞的存活率為80％左右，干細胞安全難以保證，一些凍存方法還存在操作復雜缺點。

發明內容

為了克服現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的在于提供一種造血干細胞凍存液，該造血干細胞凍存液配方簡單，原料便宜，能有效保護造血干細胞免受冷凍損傷，安全性高，對細胞的損傷小，可以提高造血干細胞的復蘇成活率，復蘇后的成活率可以達到96%以上，且復蘇后細胞活率高、細胞增殖數量大、細胞不易老化，并保證了造血干細胞復蘇后的生理功能和生物學特性，微生物檢測指標符合要求，延長了造血干細胞的存活期。

本發明的目的在于提供一種造血干細胞凍存方法，該造血干細胞凍存方法可以有效解決造血干細胞無法存儲、長時間運輸的問題，實現了造血干細胞的本地采集、異地制備以及即時復蘇的應用，為臨床外周血造血干細胞的儲存應用及造血干細胞移植提供可靠保證。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種造血干細胞凍存液，所述造血干細胞凍存液包括如下重量份的原料：

二甲基亞砜10-20mL

羥乙基淀粉6-10g

細胞培養基4-8mL

人血清白蛋白6-10mL

人自體血漿60-100mL。

所述二甲基亞砜為SIGMA型號為472301的二甲基亞砜。二甲基亞砜能提高細胞膜對水的通透性，降低溶液的冰點，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。

羥乙基淀粉是大分子非通透性細胞保護劑，可使細胞脫水，減少細胞內冰晶形成，對細胞膜具有保護作用。

本發明采用在造血干細胞凍存液中添加人血白蛋白作為細胞凍存穩定劑使用，有利于在冷凍復蘇過程中調節滲透壓，對細胞保護作用好，并且凍存液成本低，可進一步提高凍存細胞的存儲穩定性，避免由于細胞存儲供者血質問題導致過程儲存活性不穩定或細胞復蘇率下降。

本發明的造血干細胞凍存液通過采用二甲基亞砜、羥乙基淀粉及人血清白蛋白聯合應用，可以有效地使干細胞凍存實現通透性保護作用，不僅降低冰點并延緩細胞冷凍過程，還增加干細胞的非通透性細胞保護作用，少細胞內冰晶形成，有效保護細胞膜，同時實現對干細胞的直接保護作用。

本發明的造血干細胞凍存液通過采用上述原料，并嚴格控制各原料的重量配比，制得的造血干細胞凍存液能有效保護造血干細胞免受冷凍損傷，安全性高，對細胞的損傷小，可以提高造血干細胞的復蘇成活率，復蘇后的成活率可以達到96%以上，且復蘇后細胞活率高、細胞增殖數量大、細胞不易老化，并保證了造血干細胞復蘇后的生理功能和生物學特性，微生物檢測指標符合要求，延長了造血干細胞的存活期。

優選的，所述細胞培養基為X-VIVO15培養基、AIM-V培養基、DMEM/F12培養基、RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、GT-T561培養基和Stemspan培養基中的任意一種。