[發(fā)明專利]一種免疫細(xì)胞凍存液及免疫細(xì)胞凍存方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710399780.5
• 申請(qǐng)日: 2017-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN107047541A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅天恩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東莞市保萊生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 東莞市華南專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44215
• 代理人: 姜華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫細(xì)胞凍存液及免疫細(xì)胞凍存方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療的弊端，已經(jīng)被公認(rèn)為二十一世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有發(fā)展前途的一種治療手段,也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細(xì)胞的治療手段。

免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。免疫細(xì)胞可以分為多種，在人體中各種免疫細(xì)胞擔(dān)任著重要的角色。從血液中分離出來的單個(gè)核細(xì)胞包括：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞等，是免疫細(xì)胞治療中的初始細(xì)胞來源，經(jīng)各類細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，得到一群具有高效殺傷活性的免疫細(xì)胞群。

常見的免疫細(xì)胞治療種類包括NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、TIL細(xì)胞、LAK細(xì)胞、CART細(xì)胞等。所有這些經(jīng)誘導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)的免疫細(xì)胞的初始細(xì)胞來源都是外周血或臍血的單個(gè)核細(xì)胞，而且是直接分離培養(yǎng)。隨著年齡的增長(zhǎng)，免疫細(xì)胞在體內(nèi)的活性也會(huì)隨之降低，所以在年輕時(shí)期凍存具有較高活性的免疫細(xì)胞，對(duì)于未來罹患腫瘤相關(guān)疾病的治療可以起到很好的保障，因此免疫細(xì)胞凍存及凍存后的復(fù)蘇培養(yǎng)具有非常大的意義。除此之外，隨著免疫細(xì)胞治療項(xiàng)目的逐步推廣，免疫細(xì)胞的遠(yuǎn)程運(yùn)輸，長(zhǎng)期保存問題就凸顯出來，也是細(xì)胞制備區(qū)域化進(jìn)程中必須解決的問題。

目前，細(xì)胞凍存主要是采取-196℃超低溫條件下的保存方案，在超低溫條件下，細(xì)胞的代謝功能停滯，但并未死亡。而細(xì)胞復(fù)蘇則主要采用凍存細(xì)胞在37℃快速解凍的方法，以恢復(fù)細(xì)胞的活性和功能。但是現(xiàn)有的免疫細(xì)胞凍存方法適用于凍存干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，對(duì)于免疫細(xì)胞，在凍存過程中則易形成冰晶損傷細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞活率低、細(xì)胞增殖數(shù)量不足、細(xì)胞易老化，存在效率低下，凍存質(zhì)量不高、細(xì)胞復(fù)蘇后活性差以及成活率不高等問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種免疫細(xì)胞凍存液，該免疫細(xì)胞凍存液能有效保護(hù)免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，安全性高，對(duì)細(xì)胞的損傷小，可以提高免疫細(xì)胞的復(fù)蘇成活率，復(fù)蘇后的成活率可以達(dá)到96%以上，且復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖數(shù)量大、細(xì)胞不易老化，并保證了免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，微生物檢測(cè)指標(biāo)符合要求，延長(zhǎng)了免疫細(xì)胞的存活期，減少了免疫細(xì)胞表面抗原的丟失。

本發(fā)明的目的在于提供一種免疫細(xì)胞凍存方法，該免疫細(xì)胞凍存方法可以有效解決免疫細(xì)胞無法存儲(chǔ)、長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸?shù)膯栴}，實(shí)現(xiàn)了免疫細(xì)胞的本地采集、異地制備以及即時(shí)復(fù)蘇的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種免疫細(xì)胞凍存液，所述免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：

二甲基亞砜4-8mL

右旋糖酐2-6mL

細(xì)胞培養(yǎng)基10-30mL

人血清白蛋白1-5mL

人自體血漿60-100mL。

所述二甲基亞砜為SIGMA型號(hào)為472301的二甲基亞砜。二甲基亞砜能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低溶液的冰點(diǎn)，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

右旋糖酐可以維持滲透壓和pH值，提供適宜細(xì)胞存活的介質(zhì)環(huán)境。

本發(fā)明采用在免疫細(xì)胞凍存液中添加人血白蛋白作為細(xì)胞凍存穩(wěn)定劑使用，有利于在冷凍復(fù)蘇過程中調(diào)節(jié)滲透壓，對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用好，并且凍存液成本低，可進(jìn)一步提高凍存細(xì)胞的存儲(chǔ)穩(wěn)定性，避免由于細(xì)胞存儲(chǔ)供者血質(zhì)問題導(dǎo)致過程儲(chǔ)存活性不穩(wěn)定或細(xì)胞復(fù)蘇率下降。

本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用上述原料，并嚴(yán)格控制各原料的重量配比，制得的免疫細(xì)胞凍存液能有效保護(hù)免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，安全性高，對(duì)細(xì)胞的損傷小，可以提高免疫細(xì)胞的復(fù)蘇成活率，復(fù)蘇后的成活率可以達(dá)到96%以上，且復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖數(shù)量大、細(xì)胞不易老化，并保證了免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，微生物檢測(cè)指標(biāo)符合要求，延長(zhǎng)了免疫細(xì)胞的存活期，減少了免疫細(xì)胞表面抗原的丟失。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)基為X-VIVO15培養(yǎng)基、AIM-V培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、GT-T561培養(yǎng)基和Stemspan培養(yǎng)基中的任意一種。