[發(fā)明專利]多基因捕獲測(cè)序的單鏈探針制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710397693.6
• 申請(qǐng)日: 2017-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107236727B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王弢;官民曉;巴兆粉;陸亞紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇為真生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/6811
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

本發(fā)明公開(kāi)了一種多基因捕獲測(cè)序的單鏈探針制備方法，該方法包括如下步驟：1、芯片合成，2、芯片DNA洗脫，3、用含dUTP的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增芯片DNA，4、PCR產(chǎn)物用磁珠純化，5、使用單引物偏向擴(kuò)增，該引物5’端經(jīng)生物素標(biāo)記，得到含有生物素單鏈與含有dUTP的鏈的雜合雙鏈DNA，6、加入能夠識(shí)別并切除dUTP的酶，將5步中的含有dUTP的母鏈消化，7、消化后產(chǎn)物經(jīng)純化，得到含有生物素標(biāo)記的單鏈探針，8、稀釋至所需濃度并進(jìn)行分裝保存。與市售合成的探針相比，酶法反應(yīng)條件溫和，成本降低，易于推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及用于多基因捕獲測(cè)序的單鏈探針制備方法。

背景技術(shù)

基于雜交的靶向序列捕獲技術(shù)根據(jù)雜交時(shí)狀態(tài)不同，主要分為固相雜交和液相雜交。固相雜交序列捕獲技術(shù)是一種將寡核苷酸探針合成在芯片上，并在芯片上進(jìn)行雜交的高通量序列捕獲技術(shù)，可以在一個(gè)芯片上捕獲整個(gè)外顯子甚至更大的區(qū)域。但因?yàn)樾酒系墓押塑账崃枯^少，所以就需要較大的樣本起始量來(lái)推動(dòng)雜交的發(fā)生。而液相雜交是通過(guò)在溶液中，目標(biāo)DNA片段和已帶有生物素標(biāo)記探針直接雜交，然后通過(guò)生物素親和素的反應(yīng)使目標(biāo)DNA片段錨定在帶有親和素的微珠上，洗去非目標(biāo)DNA，洗脫后，富集的DNA用于測(cè)序。與固相雜交相比，液相雜交在動(dòng)力學(xué)上更具優(yōu)勢(shì)，雜交效率更高，能降低對(duì)于樣品起始量的要求。此外，液相雜交更易于操作，時(shí)間短，便于自動(dòng)化操作。相對(duì)于液相雜交而言，固相雜交已逐漸被淘汰，而液相雜交中的探針又可分為RNA探針和DNA探針。目前，市場(chǎng)上有代表性的提供探針的三家公司分別為安捷倫，羅氏和IDT，其中，安捷倫主要生產(chǎn)RNA探針，而羅氏和IDT主要生產(chǎn)DNA探針。與DNA探針相比，由于RNA探針的不穩(wěn)定性，使其在運(yùn)輸、保存及應(yīng)用等方面均不方便，成本更高。而羅氏和IDT的DNA探針的合成是通過(guò)柱式合成而后混合到一起的，而非芯片式合成的，相對(duì)與全外顯子的量，合成的的代價(jià)也是極其昂貴的，是極不易于推廣的。雖然市場(chǎng)上也有基于芯片式合成后通過(guò)PCR獲得的DNA探針，但它們都是雙鏈DNA探針。與安捷倫、羅氏和IDT的單鏈探針相比，雜交效率大大的降低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的：提供一種用于多基因捕獲測(cè)序的單鏈探針制備方法，包括捕獲目標(biāo)基因的探針制備技術(shù)及其在二代測(cè)序中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種多基因捕獲測(cè)序的單鏈探針制備方法，方法至少包括如下步驟：

(1)芯片合成，合成不同寡核苷酸數(shù)量的芯片，所述的芯片包含能夠與靶序列結(jié)合的80bp-120bp目標(biāo)區(qū)域堿基，目標(biāo)區(qū)域堿基兩端分別連接15-20bp堿基末端；

(2)芯片DNA洗脫；

(3)用含dUTP的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增芯片DNA，dUTP摩爾濃度范圍為5μM-750μM；

(4)PCR產(chǎn)物用磁珠純化；

(5)將步驟(4)中純化的PCR產(chǎn)物稀釋，作為下一步PCR的模板，使用單引物偏向擴(kuò)增，該引物5’端經(jīng)生物素標(biāo)記，得到含有生物素單鏈與含有dUTP的鏈的雜合雙鏈DNA；

(6)加入能夠識(shí)別并切除dUTP的酶，將(5)步中的含有dUTP的母鏈消化；

(7)消化后產(chǎn)物經(jīng)純化，得到含有生物素標(biāo)記的單鏈探針；

(8)對(duì)制備的單鏈探針進(jìn)行電泳檢測(cè)和濃度測(cè)定，得到每種單鏈探針物質(zhì)的量為nmol級(jí)別，將質(zhì)檢合格的探針稀釋保存。

優(yōu)選的，所述的芯片序列如下：

5′-...GACGCGTGGATCATCT(N)nTGCATTGCGTGTAGCGA...-3′,

注：虛線“...”代表可延伸的堿基末端,N選自A、C、T、G；n表示80～120的正整數(shù)。