[發(fā)明專利]一種嗜熱中性蛋白酶基因、工程菌、酶及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710396332.X
• 申請(qǐng)日: 2017-05-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107164349A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 解桂秋;高仁鈞;李杏杏;宗利;霍銳;陳曼利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/52
• 分類號(hào): C12N9/52;C12N1/21;C12N15/70;C12P21/06;C12R1/19
• 代理公司: 長(zhǎng)春吉大專利代理有限責(zé)任公司22201
• 代理人: 劉世純,王恩遠(yuǎn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱中性蛋白酶基因、生產(chǎn)該嗜熱中性蛋白酶的工程菌JD-TP(大腸埃希氏菌Escherichia coli)、利用該基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的嗜熱中性蛋白酶、自催化剪切后獲得的成熟的嗜熱中性蛋白酶、該嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶在降解蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白酶，是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)或多肽的一類水解酶。按活性中心氨基酸殘基的種類可分成絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。按反應(yīng)的pH值可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。

蛋白酶在工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，蛋白酶是臨床上使用最早、用途最廣的藥用酶之一，可用于治療消化不良、消炎、活化血管及高血壓的治療。在食品工業(yè)中，蛋白酶可用于肉軟化、生產(chǎn)乳酪、啤酒去污及制備蛋白胨等。蛋白酶是加酶洗滌劑添加的主要酶類之一，用于清除蛋白污垢。除了可添加于日用洗滌劑中，蛋白酶還可用于醫(yī)用多酶洗滌劑中，用于降解手術(shù)器械上的血紅蛋白等。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的醫(yī)用多酶洗滌劑中添加的蛋白酶主要依靠進(jìn)口，價(jià)格較高，因此開(kāi)發(fā)高活性和穩(wěn)定性的蛋白酶具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益。

中性蛋白酶是最適反應(yīng)pH在7.0左右的蛋白酶，已被應(yīng)用于食品、洗滌劑及紡織等行業(yè)。但目前國(guó)內(nèi)從事中性蛋白酶研發(fā)和銷售的酶制劑企業(yè)很少，因此，中性蛋白酶的研發(fā)有較好的研究和應(yīng)用前景。

中國(guó)專利CN 103667150公開(kāi)了一種生產(chǎn)熱穩(wěn)定的中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌，所述中性蛋白酶最適反應(yīng)溫度70℃，最適反應(yīng)pH為7.2。酶在55℃下保溫1h酶活不下降。在60℃下，30min酶活力降低了5％，1h酶活力降低15％。

酶在實(shí)際應(yīng)用時(shí)條件復(fù)雜，而中性蛋白酶的缺點(diǎn)是穩(wěn)定性差，限制了它的應(yīng)用范圍。嗜熱酶與化學(xué)催化劑相比，具有催化效率高、底物專一性強(qiáng)及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)用酶非常有潛力的來(lái)源。所以，開(kāi)發(fā)高活性、穩(wěn)定性的嗜熱中性蛋白酶，可為工業(yè)用蛋白酶提供優(yōu)質(zhì)候選酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是利用PCR方法從嗜熱細(xì)菌獲得一種嗜熱中性蛋白酶基因；

本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用上述嗜熱中性蛋白酶基因通過(guò)生物工程技術(shù)構(gòu)建一種嗜熱中性蛋白酶工程菌；

本發(fā)明的再一個(gè)目的是利用上述嗜熱中性蛋白酶工程菌制備一種活性高、穩(wěn)定性好的嗜熱中性蛋白酶；

本發(fā)明利用上述嗜熱中性蛋白酶經(jīng)過(guò)自催化剪切獲得高活性、高穩(wěn)定性的成熟的嗜熱中性蛋白酶。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)對(duì)嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶的性質(zhì)研究，提供嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶在蛋白質(zhì)降解應(yīng)用領(lǐng)域中的應(yīng)用。

嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus HB8于1995年從日本溫泉中分離，可在65～85℃生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為75℃。該菌的基因組測(cè)序已經(jīng)完成(NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索號(hào)NC_006461，Masui R.,Kurokawa K.,Nakagawa N.,Tokunaga F.,Koyama Y.,Shibata T.,Oshima T.,Yokoyama S.,Yasunaga T.and Kuramitsu S.)，我們?cè)谄浠蚪M中發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能編碼嗜熱絲氨酸蛋白酶的基因(TTHA0724)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含1305bp，編碼的蛋白質(zhì)序列如序列表SEQ ID NO.2所示，包含434aa。經(jīng)Signal P信號(hào)肽在線分析工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析確定蛋白序列中N末端第1～19位氨基酸為信號(hào)肽序列，通過(guò)質(zhì)譜分析蛋白分子量(如圖1所示)確定第20～109位氨基酸序列為N端前肽，第110～434位氨基酸序列為成熟的嗜熱中性蛋白酶(我們通過(guò)質(zhì)譜分析分子量確定切割位點(diǎn)在第109和110位氨基酸之間)。

絲氨酸蛋白酶一般以前體蛋白(pre-pro-protease)形式表達(dá)，包括信號(hào)肽序列、N端前肽和成熟酶區(qū)三部分。信號(hào)肽的功能是保證蛋白質(zhì)從生產(chǎn)細(xì)胞釋放到胞質(zhì)或胞外培養(yǎng)基中，在經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外時(shí)被信號(hào)肽酶從前體蛋白上切下來(lái)。去除信號(hào)肽后的蛋白被稱為酶原(pro-protease)，通常是沒(méi)有活性的，其經(jīng)過(guò)處理后去除N端前肽，成為有活性的成熟酶，這種剪切起因于絲氨酸蛋白酶的自消化或自催化剪切。