[發明專利]一種高產莽草酸突變體的制備方法

有效

• 申請號: 201710395727.8
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107446870B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 唐雙焱;梁朝寧;李恒
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 北京律和信知識產權代理事務所(普通合伙) 11446
• 代理人: 鮑曉芳;武玉琴

本發明針對目前莽草酸產量無法實現高通量篩選的現狀，提供了一種高產莽草酸的基因功能缺失大腸桿菌，其特征在于，基因sucC、或agp、或nanS、或pphB、或bglF、或promoter of sdhCDAB?sucABCD operon、或gnd所表達的蛋白缺失功能；所述的基因sucC具有序列表中SEQ ID NO.1所述的堿基序列；所述的基因agp具有序列表中SEQ ID NO.2所述的堿基序列；所述的基因nanS具有序列表中SEQ ID NO.3所述的堿基序列；所述的基因pphB具有序列表中SEQ ID NO.4所述的堿基序列；所述的基因bglF具有序列表中SEQ ID NO.5所述的堿基序列；所述的基因promoter of sdhCDAB?sucABCD operon具有序列表中SEQ ID NO.6所述的堿基序列；所述的基因gnd具有序列表中SEQ ID NO.7所述的氨基酸堿基序列。本發明實現了莽草酸產量的高產量。

技術領域

本發明涉及莽草酸篩選方法的技術領域。

背景技術

莽草酸(shikimic acid,SA)是合成芳香族氨基酸、生物堿及許多高附加值生物產品的重要中間體。近年來，禽流感疫情在全球范圍內蔓延，莽草酸作為唯一有效預防和治療禽流感藥物磷酸奧司米韋(商品名“達菲”)的關鍵原料，因此備受關注。除此之外，莽草酸還可應用于合成抗腫瘤藥物二惡霉素、乙二醛酶抑制劑。相較于傳統的從諸如八角等植物果實中提取的方法和化學合成的方法，微生物發酵法生產莽草酸具有無可比擬的優勢，如生產周期短、環境危害小、成本低等。其中，以經典工程菌株大腸桿菌作為宿主合成莽草酸為常用的微生物合成方式之一。

作為一種小分子化合物，盡管莽草酸有巨大的市場需求，但目前并無高產量的微生物發酵法生產莽草酸。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對目前莽草酸產量無法實現高產量現狀。

首先，本發明提供了一種高產莽草酸的基因功能缺失大腸桿菌，基因sucC、或agp、或nanS、或pphB、或bglF、或promoter of sdhCDAB-sucABCD operon、或gnd所表達的蛋白缺失功能；

所述的基因sucC具有序列表中SEQ ID NO.1所述的堿基序列；

所述的基因agp具有序列表中SEQ ID NO.2所述的堿基序列；

所述的基因nanS具有序列表中SEQ ID NO.3所述的堿基序列；

所述的基因pphB具有序列表中SEQ ID NO.4所述的堿基序列；

所述的基因bglF具有序列表中SEQ ID NO.5所述的堿基序列；

所述的基因promoter of sdhCDAB-sucABCD operon具有序列表中SEQ ID NO.6所述的堿基序列；

所述的基因gnd具有序列表中SEQ ID NO.7所述的堿基序列。

其次，本發明還提供了一種生產莽草酸的方法：將paroG^fbr電轉化于基因功能缺失大腸桿菌菌株DH5αΔaroA中，之后涂于卡納霉素平板(50μg/ml)，將得到的菌種以0.01OD接種到LB培養基中，在250rpm、37℃條件下培養12h，利用HPLC檢測發酵液中莽草酸產量。

進一步地，所述的paroG^fbr為：

具有序列表中SEQ ID NO.8所示的堿基序列或SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列的蛋白質，或

具有序列表中SEQ ID NO.9所示的堿基序列或SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列的蛋白質，或

具有序列表中SEQ ID NO.10所示的堿基序列或SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列的蛋白質，或