[發(fā)明專利]引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710393607.4
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107345211A
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫晗笑;利時雨;黃俊麗;賀凱
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州弘寶元生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12R1/645
• 代理公司: 北京萬貝專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11520
• 代理人: 陳領(lǐng)

1.一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：以經(jīng)Δ6-去飽和酶基因重組的工程菌為載體，引入外源多肽被包裹進經(jīng)Δ6-去飽和酶基因重組的工程菌的脂滴內(nèi)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：所述外源多肽是α-MSH或者多肽H22LP。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：所述工程菌為導(dǎo)入Δ6-去飽和酶(D6D)基因重組的粘紅酵母GM4-D6D。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：所述Δ6-去飽和酶由刺孢小克銀漢霉的D6D基因的分離與擴增得到的。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：Δ6-去飽和酶(D6D)基因重組的粘紅酵母的構(gòu)建方法,其包括的步驟如下：

(1)表達載體pPGK1Z-rD-ME的抽提；

(2)連接PGK1基因和D6D基因；

(3)PGK1-D6D片段與表達載體載體的雙酶切反應(yīng)、連接。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：表達載體pPGK1Z-rD-ME的抽提的方法的步驟如下：

(1)將含有pPGK1Z-rD質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α接種到裝有5mL LB-amp培養(yǎng)基中，于37℃下250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；

(2)吸取1.5mL過夜菌液于離心管中，4℃下12000rpm離心1分鐘，棄上清；

(3)用濾紙吸干離心管中的液體培養(yǎng)基，將菌體沉淀懸浮于200μLSTET緩沖液中，用渦旋混合器混勻；

(4)加入4mL溶菌酶溶液，混勻后于室溫下靜置5分鐘；

(5)用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時45秒，取出后立刻12000rpm離心5分鐘；

(6)用無菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入8mL 5％CTAB，用混合器混勻后，13000rpm離心5分鐘，棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體；

(7)加入1.2M NaCl 300mL，充分溶解沉淀物，再加入750mL的預(yù)冷乙醇，充分混勻后，13000rpm離心15分鐘，棄上清液；

(8)取1mL 70％冷乙醇，緩慢淋洗離心管內(nèi)壁，13000rpm離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mL TE緩沖液中，混合器混勻，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：粘紅酵母與D6D基因片段的摩爾比要控制在1:3-10。

8.一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：包括的步驟如下：

(1)制備工程菌株GM4-D6D菌株感受態(tài)細胞；

(2)將10μg修飾了的外源多肽溶解后與感受態(tài)細胞混合后共100μL，加入電轉(zhuǎn)化杯中；

(3)電擊化；

(4)電擊結(jié)束后，立即向轉(zhuǎn)化杯中加入900μL預(yù)冷的1M山梨醇溶液，用槍輕微吸打混勻，然后將其轉(zhuǎn)至滅過菌的離心管中，30℃靜置1h，離心后加入1mL新鮮的YPD培養(yǎng)基重懸菌體，30℃，200rpm搖1小時；

(5)得到的菌株。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：所述電擊化步驟如下：

(1)將80μL己制備好的感受態(tài)細胞與20μL已線性化好的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA混合,加入到0.2cm已預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；

(2)將裝有混合液的電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；

(3)調(diào)整好電轉(zhuǎn)儀的參數(shù):電壓1.5kV，電容25uF，電阻200Ω，電擊持續(xù)時間為5ms；

(4)電擊結(jié)束后，立即向轉(zhuǎn)化杯中加入1mL預(yù)冷的1M山梨醇溶液,用槍輕微吸打混勻,然后將其轉(zhuǎn)至滅過菌的離心管中,30℃靜置1h，然后加入1mL新鮮的YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖1小時；

(5)室溫下3000rpm，離心4min，用200μL ddH2O重懸菌體；

(6)將消液涂布于含50μL Zeocin的YPD平板，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d,直到長出單菌落為止。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種引入外源多肽的活細胞脂質(zhì)體，其特征在于：在多肽相關(guān)藥物和肽類分子相關(guān)功能性食品制備中的應(yīng)用。