[發(fā)明專利]一種用于擴(kuò)增SMN1基因的PCR引物對和用于檢測SMN1基因點(diǎn)突變的試劑盒

在審

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• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107058575A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梅世月;孔祥東;白楠;胡爽
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11614
• 代理人: 張清芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及遺傳病基因檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用于擴(kuò)增SMN1 基因的PCR引物對和用于檢測SMN1基因點(diǎn)突變的試劑盒。

背景技術(shù)

脊髓性肌萎縮(SMA)是一種遺傳性神經(jīng)肌肉遺傳病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性、對稱性肢體近端和軀干肌肉無力、萎縮、呼吸衰竭，是發(fā)病率第二高的致死性常染色體隱性遺傳病。目前尚無有效的治療方法。SMA在活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率約為1/6000～1/10 000，人群中的攜帶率為1/35～1/80，最新的報(bào)道稱中國人群的攜帶率為1/42。SMA最主要的致病基因是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(SMN)，該基因突變導(dǎo)致脊髓前角細(xì)胞(脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)退化、變性，使得患者肌肉日漸萎縮。SMN基因定位于5q13區(qū)，具有兩個(gè)高度同源的基因拷貝：SMN1和SMN2。SMN1基因表達(dá)完整而穩(wěn)定的SMN功能蛋白，是SMA的決定性基因，SMN1基因缺陷造成SMA表型；SMN2 基因與SMN1基因序列高度相似，僅存在5個(gè)堿基的差異，分別位于第7、 8外顯子和第6、7內(nèi)含子中，其中第7外顯子上的C/T的差異，導(dǎo)致SMN2 在初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-mRNA剪切加工時(shí)發(fā)生外顯子跳躍，產(chǎn)生的mRNA較 SMN1缺失第7外顯子；研究表明，只有10％-15％的SMN2基因能表達(dá)為全長的SMN蛋白，因此也被成為SMA的補(bǔ)償基因。已有統(tǒng)計(jì)表明，約95％的SMA患者為SMN1基因純合缺失型(第7和/或第8外顯子純合缺失)，約5％為SMN1基因雜合缺失型(第7和/或第8外顯子雜合缺失)與點(diǎn)突變形成復(fù)合雜合突變所致。

根據(jù)SMA的致病基因特點(diǎn)，現(xiàn)有的基因診斷技術(shù)主要是分析SMN1 基因第7外顯子是否有缺失及缺失數(shù)目，不適合用于檢測SMN1基因點(diǎn)突變(包括錯(cuò)義、無義、移碼、剪切位點(diǎn)突變)。對于點(diǎn)突變的檢測，由于SMN1 存在高度同源的SMN2基因且基因體長達(dá)32kb，常規(guī)的PCR-Sanger測序方法難以避免SMN2基因的干擾，給點(diǎn)突變的檢測帶來了極大的困難。目前通常采用的方法有兩種：(1)通過提取總RNA，然后利用SMN1特異性引物反轉(zhuǎn)錄cDNA，再進(jìn)行PCR-Sanger測序；(2)應(yīng)用這兩個(gè)基因在第8 外顯子和第6內(nèi)含子差異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物，分析第7、8外顯子的序列突變情況。這兩種方法前期處理的工作量大，程序復(fù)雜耗費(fèi)大量人力，成本高昂，效率低下；并且不能分析剪切位點(diǎn)突變，第二種方法只能檢測第7、8外顯子突變。

因此，本領(lǐng)域仍然需尋求一種新的檢測SMN1基因點(diǎn)突變的方法，提高診斷準(zhǔn)確率，簡化操作流程，提高時(shí)效性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于擴(kuò)增SMN1基因的PCR引物對和用于檢測SMN1基因點(diǎn)突變的試劑盒。利用本發(fā)明的SMN1特異性引物，首先特異性擴(kuò)增SMN1超長片段，然后以長片段PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式PCR、對SMN1基因的全部外顯子擴(kuò)增，以實(shí)現(xiàn)對SMN1基因點(diǎn)突變的檢測。

根據(jù)本發(fā)明，長片段PCR(Long Range-PCR，LR-PCR)是指擴(kuò)增長度大于5kb的PCR，與常規(guī)的短片段PCR相比，最大的區(qū)別在于，其受DNA 模板的二級結(jié)構(gòu)、引物的特異性和退火溫度、以及不理想的循環(huán)條件等因素影響較大，以至于超長片段PCR的擴(kuò)增難度較大。

為了保證擴(kuò)增的特異性，只擴(kuò)增SMN1真基因，設(shè)計(jì)引物時(shí)，首先比對SMN1基因和SMN2基因及上下游序列，尋找差異性位點(diǎn)；在該位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增的上下游引物；為了進(jìn)一步提高擴(kuò)增的特異性，降低錯(cuò)配發(fā)生的概率，在差異性位點(diǎn)采用鎖核酸(LNA)修飾核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種用于擴(kuò)增SMN1基因的PCR 引物對，該P(yáng)CR引物對包括具有SEQ ID NO：1所示堿基序列的引物和具有SEQ ID NO：2所示堿基序列的引物：

5'-GTGTTTAAGGATCTGCCGCCT-3'(SEQ ID NO：1)

5'-CGTGGCTGAGGCACGAGAACC-3'(SEQ ID NO：2)

其中，SEQ ID NO：1中位于3’端第2-4位的堿基、SEQ ID NO：2中位于5’端第6位和3’端第1位的堿基均為鎖核酸修飾。

本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，鎖核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)是一種寡核甘酸衍生物，和普通寡核甘酸分子區(qū)別在于其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè) 2’-O，4’-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核甘酸單體，核糖的2’-O位和4’-C位通過亞甲基橋連接起來，成環(huán)形。