[發明專利]一種利用分子標記鑒別黑唇苜蓿盲蝽種群的方法

在審

• 申請號: 201710390023.1
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107099600A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 張利娟;崔金杰;雒珺瑜;張帥;馬妍;王春義;呂麗敏;朱香鎮;王麗
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.用于鑒定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)種群的特異性引物組合，其特征在于，所述特異性引物組合包括兩個引物對，分別以黑唇苜蓿盲蝽線粒體細胞色素氧化酶I基因和線粒體NADH脫氫酶亞基4基因為靶序列，引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示。

2.權利要求1所述的特異性引物組合在制備鑒定黑唇苜蓿盲蝽種群試劑盒中的用途。

3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的種群為東北種群和華北種群。

4.一種鑒定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)種群的試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述的特異性引物組合。

5.根據權利要求4所示的試劑盒，其特征在于，還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液、標準陽性模板中的至少一種。

6.一種利用分子標記鑒別黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)種群的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取黑唇苜蓿盲蝽基因組DNA；

(2)以步驟(1)中提取的DNA樣品為模板，利用權利要求1所述的特異性引物組合分別進行PCR擴增反應；

(3)兩次PCR產物純化，測序，串聯，分析。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，25μL的PCR反應體系為：2×Taq PCR Master Mix反應緩沖液12.5μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，無菌水補足至25μL。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性1min，退火溫度下退火1min，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸5min；

所述退火溫度為當檢測引物為SEQ ID NO.1-2時，退火溫度為49℃，當檢測引物為SEQ ID NO.3-4時，退火溫度為59.5℃。

9.根據權利要求6-8任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中分別對PCR產物進行純化和測序后，將測序結果按照COI-ND4進行串聯拼接，串聯序列長度為1763bp，當第144、690、1188、1676、1704bp處堿基依次為A、A、T、T、A時，待測樣品為黑唇苜蓿盲蝽東北種群；當第144、690、1188、1676、1704bp處堿基依次為G、G、C、G、T時，待測樣品為黑唇苜蓿盲蝽華北種群。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，當堿基第81位為A，或第687位為T，或第822位為G，或第1127位為G，或第1257位為G，或第1617位為A，則待測樣品為黑唇苜蓿盲蝽東北種群；當堿基第81位為G，或第687位為C，或第822位為A，或第1127位為A，或第1257位為A，或第1617位為G，則待測樣品為黑唇苜蓿盲蝽華北種群。