[發明專利]將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層干/祖細胞的方法及應用

有效

• 申請號: 201710389711.6
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107142240B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 王韞芳;王術勇;張文成;覃金華;王璇;常銘洋;閆舫;裴雪濤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層干/祖細胞的方法，包括以下步驟：

1)將原代分離的消化道來源上皮細胞作為起始細胞，擴增培養所述消化道來源上皮細胞；

2)用絲裂霉素-C處理滋養層細胞后清洗，并用酶消化細胞后備用；

3)將步驟2)準備的滋養層細胞添加于步驟1)擴增培養的消化道來源上皮細胞中，繼續共培養過夜；

4)第2天更換為重編程培養基，每2-3天換一次培養基，培養7-15天，得到誘導內胚層干/祖細胞克隆；

步驟4)中所述重編程培養基為小分子化合物組合與基礎培養基和細胞培養基礎添加成分的混合物；其中所述小分子化合物組合為FBP、簡稱為Bay的Bay K 8644、簡稱為Bix的Bix01294、簡稱為SB的SB431542、VPA、簡稱為RG的RG108、PD0325901和PS48，或為Bay K8644、Bix01294、簡稱為A83的A83-01、VPA、RG108、PD0325901和PS48的化合物組合，統稱為8M組合，或為Bix01294、Bay K 8644、RG108和SB431542的化合物組合，簡稱BBRS組合，或為A83-01、Bay K 8644、RG108和Bix01294的化合物組合，簡稱BBRA組合。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1)中的起始細胞為消化道來源上皮細胞，包括胃上皮細胞和十二指腸上皮細胞，起始細胞用Kubota培養基在37攝氏度，5％CO₂培養箱條件下培養5天。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述胃上皮細胞為NCAM陽性的胃上皮細胞。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中的滋養層細胞為消化道來源的基質細胞，包括胃肌成纖維細胞或小腸肌成纖維細胞。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述滋養層細胞為人胃肌成纖維細胞；用絲裂霉素-C處理人胃肌成纖維細胞2-3小時，用PBS清洗細胞，用TrypLE酶消化細胞。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)按1～3×10⁵每平方厘米的密度將步驟2)準備的滋養層細胞添加于步驟1)培養到5天的消化道來源上皮細胞中，在37℃、5％CO₂培養箱中過夜或12-16小時。

7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于：所述8M組合為SB43154：VPA：PD0325901：RG108：Bix01294：Bay K 8644：PS48：FBP按摩爾比為50：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的組合；或A83：VPA：PD0325901：RG108：Bix01294：Bay K 8644：PS48：FBP按摩爾比為12.5：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的組合，且按該配比的8M組合在使用中滿足RG使用濃度為0.01～1μM。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：在使用中滿足RG使用濃度為0.04μM。

9.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于：所述BBRS組合和BBRA組合中各化合物使用濃度為：SB43152為1～10μM，A83為0.4～1μM，RG108為0.01～1μM，Bix01294為0.1～2μM，Bay K 8644為1～4μM。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于：BBRS組合為各化合物按SB：RG：Bix：Bay摩爾比50:1:12.5:50的組合，BBRA組合為各化合物按A83：RG：Bix：Bay摩爾比12.5:1:12.5:50的組合。