[發(fā)明專利]一種利用高效液相測定沸石分子篩抗菌劑抗菌機理的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710386775.0
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107179364B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王秀麗;沈陽陽;陳南春;李子院;李海云
• 申請（專利權(quán)）人: 桂林理工大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用高效液相測定沸石分子篩抗菌劑抗菌機理的方法，其特征為以自制沸石分子篩抗菌劑為研究對象，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，利用高效液相色譜法測定抗菌劑作用后的大腸桿菌內(nèi)β-內(nèi)酰胺酶含量和金黃色葡萄球菌菌體蛋白的含量變化，以闡述沸石分子篩抗菌劑的抗菌機理；

具體步驟為：

(1)沸石分子篩抗菌劑為自制，P型分子篩：殼聚糖：二甲酸鉀：＝3：1：2合成沸石分子篩抗菌劑，主要是二甲酸鉀起到抗菌作用；

(2)配制含二甲酸鉀濃度為0～96mg/mL的沸石分子篩抗菌劑溶液；

(3)根據(jù)步驟(2)，每種菌增加3個空白對照組后，配制普通液體的培養(yǎng)基，并滅菌。再加入處于對數(shù)生長期的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌，按每100mL培養(yǎng)基接種2mL菌懸液，然后分別加入抗菌劑5mL并做好標記后轉(zhuǎn)移至37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；

(4)取步驟(3)培養(yǎng)液用普通液體培養(yǎng)基稀釋100倍，再放入37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～18h，停止培養(yǎng)；

(5)取步驟(4)培養(yǎng)液，5000r/min離心15min，取沉淀加入0.05mol/L pH 7.0的磷酸鉀緩沖液，超聲處理，超聲條件為120W 15min；菌體溶液于4℃、10000r/min離心30min，棄去上清液，以0.05mol/L pH 7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌沉淀物兩次后，再將沉淀重新混入同樣的溶液中，反復凍融破壞細菌菌體，然后4℃、10000r/min、60min離心3次，獲得上清液即為粗酶液，過膜處理后進行HPLC檢測；

(6)根據(jù)步驟(2)，在增加3個空白對照組后，共需配制21個100mL普通液體培養(yǎng)基，并滅菌；再將大腸桿菌菌懸液按每個培養(yǎng)基2mL量接種，并加入頭孢西丁100mg誘導β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生，轉(zhuǎn)移至37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)共12小時后，取出將培養(yǎng)基擴充到200mL再加入(2)沸石分子篩抗菌劑不同濃度，并做好標記，繼續(xù)培養(yǎng)12小時；

(7)β內(nèi)酰胺酶粗酶液的提取：方法同(5)獲得的粗酶液；將粗酶液冷凍濃縮后用Nitrocefin試紙檢測粗酶液中是否含有β-內(nèi)酰胺酶；

(8)大腸桿菌色譜條件：色譜柱：AgilentTC-C18，規(guī)格為150mm×4.6mm，或SupelcosilLC-18-DB，規(guī)格為250mm×4.6mm；流動相為：A為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液；B為甲醇；梯度洗脫：0～5min，B：10％～15％；5～12min，B：15％～25％；12～25min，B：25％～55％；檢測UV：220nm；流速：1.0mL/min；進樣量：25μL；柱溫：30℃；

(9)金黃色葡萄球菌色譜條件：色譜柱：AgilentTC-C18，規(guī)格為150mm×4.6mm，或Supelcosil LC-18-DB，規(guī)格為250mm×4.6mm，粒徑3.5μm；流動相為水：乙腈＝1:3；流速：1.0mL/min；檢測UV：254nm；進樣量：20μL，檢測時間：20min；柱溫：30℃。