[發(fā)明專利]一種植物基因組多位點編輯載體pCXUN-CAS9-RGR

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710384742.2
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN108949805B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙云德;王榮臣;張濤;和玉兵;楊寧
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種植物基因組多位點編輯載體pCXUN-CAS9-RGR，其特征包括，該載體通過下列步驟制備獲得：

(1)以SEQ ID NO：1所示的序列的起始載體pCXUN為材料，用Xcm1切除該載體中的登陸號為NC_007635.1的ccd基因；

(2)在步驟(1)Xcm1切除了載體ccd基因的位置，即744-438堿基位上定向插入SEQ IDNO：4所示的CAS9基因片段，得到如SEQ ID NO：4所示的中間載體pCXUN-CAS9；

(3)將步驟(2)中所得到的中間載體pCXUN-CAS9，用KpnISacI消化成線性DNA，引入兩個RGR，所述的RGR的引入為下列方式:

1)首先選擇靶基因特異性序列g(shù)RNA，用NEB Cutter軟件在http://nc2.neb.com/NEBcutter2/網(wǎng)站界面上輸入目的基因序列，或者從相關(guān)網(wǎng)站上篩選找到23nt的靶序列：

N¹N²N³N⁴N⁵N⁶N⁷N⁸N⁹N¹⁰N¹¹N¹²N¹³N¹⁴N¹⁵N¹⁶N¹⁷N¹⁸N¹⁹N²⁰NGG，其中N代表任意堿基；

2)通過PCR將以下片段中的Hammerhead Ribozyme即錘頭核酶序列置于gRNA的5’端，將D型肝炎病毒核酶序列置于gRNA的3’端，得到人工合成的RGR序列單元，具體序列如下所示：

最后以該人工合成的RGR序列單元為模板得到攜帶靶基因的RGR-基因，將靶位點的兩個RGR通過重疊PCR串聯(lián)在一起形成RGR-基因1+RGR-基因2；

在上述引入片段中：

波浪線的堿基部分為靶基因序列前六個堿基的互補(bǔ)配對序列，人工合成的RGR序列單元的位置為1-6bp；

斜體堿基部分為Hammerhead Ribozyme即錘頭核酶序列，人工合成的RGR序列單元的位置為7-42bp；

方框堿基部分為D型肝炎病毒的核酶序列，人工合成的RGR序列單元的位置為176-243bp；

下劃線的堿基部分是設(shè)計的基因靶位點序列，人工合成的RGR序列單元的位置為43-62bp；

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT是gRNA核心序列，人工合成的RGR序列單元的位置為63-175bp；

M⁶M⁵M⁴M³M²M¹與N¹N²N³N⁴N⁵N⁶補(bǔ)配對；

3)選擇Rice U6或U3或其他不同類型啟動子通過重疊PCR引入在RGR序列單元的5’端，得到啟動子-RGR-基因1-RGR-基因2片段；所述的U6啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的U3啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

4)用Gibson一步快速連接法將U6或U3-RGR-基因1-RGR-基因2連接到線性化載體pCXUN-CAS9中，得到轉(zhuǎn)化載體pCXUN-Cas9-RGR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

2.權(quán)利要求1所述的一種植物基因組多位點編輯載體pCXUN-Cas9-RGR在水稻轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。