[發明專利]一種利用SCoT分子標記分析草果遺傳多樣性的方法

有效

• 申請號: 201710384534.2
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN108330162B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 盧丙越;馬孟莉;王田濤;孟衡玲;雷恩;蘇一蘭;李春燕;劉艷紅;張虹;張薇;袁盛勇
• 申請（專利權）人: 紅河學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種利用SCoT分子標記分析草果遺傳多樣性的方法，其特征在于，其步驟包括：

(1)采用2×CTAB法提取草果基因組DNA以備用；

(2)采用SCoT-PCR反應體系對步驟(1)中提取的DNA樣品進行擴增；

(3)將PCR擴增產物在5%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，電泳結束后銀染檢測條帶；

(4)草果遺傳多樣性分析：利用10條SCoT分子標記將不同來源的草果進行聚類分析，并進行各遺傳多樣性參數的統計；

其中，所述步驟（2）中進行擴增的引物由擴增10條SCoT分子標記的引物SCoT2、SCoT7、SCoT11、SCoT13、SCoT15、SCoT21、SCoT29、SCoT31、SCoT32和SCoT33組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.10所示；

所述步驟(4)中利用10條SCoT分子標記將不同來源的草果進行聚類分析，并進行各遺傳多樣性參數的統計，具體為：讀取步驟(3)獲得的譜帶信息，將電泳圖譜上100～2000bp范圍內清晰且重復出現的條帶記為1，同一位置沒有條帶記為0，由此生成0和1原始矩陣；統計每條引物擴增出的總條帶數和多態性條帶數；用NTSYS-pc(2.10e)軟件中SimQual程序計算相似系數矩陣，以Clustering程序中SHAN進行UPGMA聚類；用Tree plot模塊生成聚類圖，構建分子進化樹，根據01二元數據矩陣，統計SCoT擴增產物的條帶總數和多態性條帶數NPB，計算多態性條帶所占的比率PPB和引物多態性信息含量PIC，PIC_i＝2f_i(1－f_i)，公式中PIC_i表示第i個位點的多態性信息含量，f_i表示有帶所占的頻率，(1－f_i)表示無帶所占的頻率；對每條引物來說，PIC＝∑PIC_i/n，式中n表示每條引物的多態性條帶數；對每條引物而言，標記指數MI可以按下述公式計算：MI＝NPB×PIC；采用POPGene32軟件對所有試驗材料進行遺傳多樣性參數計算：等位基因數、有效等位基因數、Shannon's信息指數、基因多樣性指數、多態位點比率。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)采用2×CTAB法提取草果基因組DNA以備用，具體為：采用2×CTAB法提取DNA，并將提取的DNA樣品溶于TE緩沖液后存儲于-20℃備用，擴增前用雙蒸水將DNA 樣品稀釋成20ng/μL的工作液，作為PCR擴增反應的模板。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述SCoT-PCR反應體系具體為：每25μL的反應體系中含有不含Mg²⁺的10×PCR buffer 3.0μL、Taq酶0.5U、Mg²⁺ 2.5 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.5μmol/L和模板DNA 60ng；將上述反應混合液按如下程序進行擴增：95℃預變性5 min，95℃變性1 min，48-52℃退火1 min，72℃延伸2min，35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存；

所述退火溫度根據所選擇的引物來確定，具體如下：

SEQ ID No.1 50℃

SEQ ID No.2 48℃

SEQ ID No.3 48℃

SEQ ID No.4 50℃

SEQ ID No.5 50℃

SEQ ID No.6 50℃

SEQ ID No.7 52℃

SEQ ID No.8 50℃

SEQ ID No.9 48℃

SEQ ID No.10 48℃。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中將PCR擴增產物在5%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，電泳結束后銀染檢測條帶，具體為：電泳結束后，將膠體從玻璃板上取下，蒸餾水漂洗，轉入含有0.2%硝酸銀的染色液中，振蕩10min，蒸餾水漂洗1次1min，轉入含2%氫氧化鈉和0.4%甲醛的顯色液中，輕輕振蕩待條帶顯色完全，將膠體轉入蒸餾水中；在凝膠成像系統下對膠體進行拍照保存。