[發明專利]一種快速檢測HER?2/neu基因表達的檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201710383567.5
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107119137B
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 陳立國;鄒偉權;張亞麗;李慶祥;母潤紅;王濤;蘇焱
• 申請（專利權）人: 廣州華弘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司44416
• 代理人: 張帥

技術領域

本發明屬于生物技術和醫學領域，具體涉及一種快速檢測HER-2/neu基因表達的檢測試劑盒。

背景技術

HER-2/neu基因又名c-erbB-2基因，屬于表皮生長因子受體家族中的一員。該家族成員還包含HER-1(EGFR)、HER-3、HER-4，在酪氨酸激酶活性位點區域存在約80％的序列同源性。它們共同調節復雜的信號傳導系統，促進腫瘤細胞的快速增殖、抑制凋亡，從而增加腫瘤的浸潤及轉移能力。HER-2/neu基因是一種原癌基因，1987年Slamon等首次報道HER-2/neu基因在乳腺癌細胞中過度表達與乳腺癌復發及生存率有關。HER-2/neu基因被確認為一種新的腫瘤標記物。 HER-2/neu基因定位于17q11—21，與拓撲異構酶Ⅱα基因相鄰，編碼的蛋白產物由1255個氨基酸組成，相對分子質量為185ku，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，全長28515bp，屬Ⅰ型跨膜受體酪氨酸激酶。HER-2/neu在調節腫瘤細胞生長、分化及存活起著重要的作用。與腫瘤的發生、轉移、預后、治療等密切相關。研究顯示在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、大腸癌、肺癌、前列腺癌中均存在不同程度的HER-2過表達，因此對HER-2表達的高效檢測對腫瘤診斷具有重要的意義。

中國專利(CN102798724B)公開了一種檢測乳腺癌HER2基因表達量的方法及其試劑盒。其所述的試劑盒包括：(1)抗體稀釋緩沖液；(2)孵育緩沖液；(3) 聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液，濃度為1x10^-6mol/L-2x10^-6mol/L； (4)ZnSe/ZnS核/殼量子點的水溶液；所述的抗體稀釋緩沖液為磷酸-NaCl緩沖液；所述的孵育緩沖液為磷酸-NaCl-胎牛血清緩沖液。

中國專利申請(CN104878076)公開了一種HER-2基因的cDNA原位雜交探針及其制備方法，所述探針的制備方法，包括：收集HER-2基因高表達的乳腺癌患者的新鮮腫瘤組織，提取所述腫瘤組織的總mRNA，將所述總mRNA逆轉錄為cDNA，將所述cDNA與引物進行PCR擴增，得到擴增產物，所述擴增產物為長度987bp的HER-2基因片段，即為所述探針的片段，構建含有所述HER-2基因的cDNA原位雜交探針序列的質粒；將所述質粒作為模板，并利用所述引物和羅氏的聚合酶鏈式反應地高辛探針合成試劑盒進行探針標記，得到所述探針。本發明使用的HER-2基因的cDNA原位雜交的探針序列，對HER-2基因DNA的顯示有明確的特異性，實現了對HER-2基因DNA水平擴增情況的檢測。

現有技術中對HER-2基因表達量檢測技術往往對儀器有較高的要求，操作復雜，試劑盒生產成本高，同時還存在特異性低的問題。

臨床醫學和基礎科學研究人們用基本的PCR程序已經成功擴增出了大量的基因片段，但是非特異性的結果和耗時的過程也開始漸漸無法滿足更加廣泛的需求。特別是面對具有特殊二級結構的高拷貝含量基因，人們往往束手無策。

世界各國的科學家對常規的PCR程序做了很多的改進，也嘗試了很多可以提高產物特異性的方法，包括熱啟動、兩步PCR和某些添加劑的應用等。熱啟動是用95℃先使具有復雜二級結構的模板DNA充分變性，再加入Taq酶，這樣做可以避免操作過程中產生非特異性序列的擴增，并將DNA聚合酶與其他反應物隔絕，避免在未達到設定溫度前就開始反應。

科學家們為了提高PCR效率和產物特異性，做了大量的研究，因此許多PCR 添加劑被發現，包括二甲亞砜、甲酰胺、甜菜堿、等。在這些添加劑中，雖然報道較多，但是效果不佳，其中，甲亞砜的作用是減弱模板DNA的二級結構的影響，便于DNA酶延伸，減少非特異性條帶，同時改善GC含量高的DNA的變性情況，使聚合酶更容易在二級結構處延伸，同時，二甲亞砜作為有機溶劑，能破壞DNA聚合酶結合的水化膜，使得DNA聚合酶變性。甘油為多羥基的醇，可以為DNA聚合酶提供羥基，使DNA聚合酶保持較高的活性保護DNA聚合酶。

三甲基甘氨酸，它可以通過與DNA大溝中的AT對結合而影響延伸反應，或者通過與DNA小溝結合，增加GC對的水化程度，降低雙螺旋DNA的穩定，使二級結構易于打開，從而使得引物能與模板充分結合。

上述方法和手段的單獨使用都獲得了一定的效果，但是對于引物和模板的要求普遍過于苛刻，適用范圍也較為局限。

發明內容