[發明專利]一種增強基因表達的自激活Gal4/UAS系統表達盒的建立

有效

• 申請號: 201710381327.1
• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107760707B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 徐坤;劉玉萬;張智英;閆娜娜;雒志新;韓寶泉;李欣憶;張嘵蘭
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了增強基因表達的自激活Gal4/UAS系統表達盒的建立，通過優化UAS數目及GAL4激活/結合域類型，找到一種增強效果較好的表達盒，由自身強啟動子CMV啟動，借助Gal4/UAS系統使轉錄和翻譯效率提高，從而產生自動激活、級聯放大的效果；在轉染后第5?10天維持較高的增強效果，第8天表達活性最高，說明表達盒增強基因表達的穩定性；在專門生產重組蛋白的CHO細胞中，增強效果大概是9倍。與現有基因表達盒相比，結構簡單、增強效果顯著，為基因治療的非病毒轉染途徑和重組蛋白生產中增強目的基因表達提供了一種途徑和新方法。

技術領域

本發明涉及一種增強基因表達的自激活Gal4/UAS系統表達盒的建立，屬于生物技術領域。

背景技術

Gal4/UAS系統最早是在釀酒酵母中發現的(Oshima Y et al.1984)，它由兩部分組成：編碼酵母轉錄激活蛋白GAL4(Transcription Factor GAL4)的基因和上游激活序列(Upstream Activation Sequence,UAS，Giniger E and Ptashne 1987；Giniger Edwardet al.1985)。釀酒酵母GAL4蛋白由881個氨基酸殘基構成，主要包含DNA結合域與DNA激活域兩部分(Laughon et al.1984；Oshima Yasuji 1982)。DNA結合域位于蛋白N端的1～65肽段，該結構域內的7-Cys-X2-Cys-X6-Cys-X6-Cys-X2-Cys-X6-Cys40肽段構成一個Zn2Cys6結構，是結合DNA的位點(Hellauer et al.1996；Liang et al.1996)。DNA激活域位于C末端，兩個結構域能夠獨立表達，即分別稱為結合蛋白(Binding protein)和激活蛋白(Activating protein)。研究發現DNA結合域在結合DNA前后結構發生了明顯的變化，使DNA結合域和特定序列結合的更加穩定。

GAL4的結合域能與特定DNA序列結合，激活下游基因的表達。GAL4結合蛋白的結合位點即上游激活序列位于Gal基因上游的100～300bp處(Guarente Leonard 1984)，Bram等通過DNA印跡法檢測發現，不同的基因位點，GAL4的結合位點數不同，大約有1～4個上游結合位點，但位點都是大約30bp的保守DNA序列(Bram et al.1986)。

GAL4是真核細胞中廣泛存在的進化相對保守的轉錄激活因子，它是一個模塊化的蛋白，從廣義上來講由DNA結合域(DNA binding domain，BD)和DNA激活域(DNA activatingdomain，AD)兩部分組成，結合的UAS區序列一般為CGG-N₁₁-CCG(Bram and Kornberg 1985；Elliott D.A.and Brand A.H.2008)。大量研究表明GAL4能夠作為一種轉錄激活因子在各種生物體比如果蠅和人類細胞中存在，這也突出了它在進化過程的不同物種中對于基因表達機理的保守性。

1993年，Brand和Perrimons首次利用Gal4/UAS系統在果蠅中表達目標基因。在這一體系中，目標基因的表達是被USA調控的，而且只有當GAL4蛋白結合到UAS后，目標基因才可以被轉錄，因此這是一種典型的雙元表達系統(Luan et al.2006)。到目前為止，該系統已經被應用于除果蠅屬(Phelps and Brand 1998)以外的其他生物體，諸如非洲爪蟾(Hartley et al.2002)、斑馬魚(Asakawa and Kawakami 2008)、小鼠(Elliott D.A.andBrand A.H.2008)等。

目前，尚未見到利用基于Gal4/UAS的表達系統在人源化細胞中進行目的基因表達的報道，而且現有表達系統還存在目的基因表達量較低、表達時間短，增強表達的穩定性差等不足，因而不利于其在基因治療的非病毒轉染途徑以及DNA疫苗等的發展和應用。

發明內容