[發明專利]一種基于CRISPR/Cas9技術制備水稻OsPIL15突變體的方法及應用

在審

• 申請號: 201710380845.1
• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107164401A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 杜彥修;季新;趙全志;晏云;孫紅正;張靜;李俊周;彭廷
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/22;A01H5/00
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種基于CRISPR/Cas9技術制備水稻OsPIL15突變體的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)gRNA靶點序列的選擇：序列為5′-GACTTCTTCTCCGAGCTCCAGG-3′，所述序列3′端的PAM序列為AGG，限制性內切酶SacⅠ識別序列為5′-GAGCTC-3′；

2)gRNA寡核苷酸鏈上下游引物的設計：

上游引物為sgRNA-F：5′-GGCGGACTTCTTCTCCGAGCTCC-3′，

下游引物為sgRNA-R：5′-AAACGGAGCTCGGAGAAGAAGTC-3′；

3)gRNA表達載體構建：將所述上下游引物混合、退火，得寡核苷酸雙鏈DNA；用內切酶BsaⅠ酶切pBUN411質粒，得線性質粒；用T4連接酶將所述線性質粒和寡核苷酸雙鏈DNA連接，得連接產物；將連接產物轉化、篩選、驗證，即得pBUN411-gRNA表達載體；

4)將pBUN411-gRNA表達載體導入農桿菌中，得CRISPR/Cas9-gRNA農桿菌；用CRISPR/Cas9-gRNA農桿菌侵染水稻愈傷組織；

5)將步驟4)獲得的愈傷組織誘導得到再生苗，篩選得到轉基因陽性植株，鑒定即得水稻OsPIL15突變體。

2.根據權利要求1所述的制備水稻OsPIL15突變體的方法，其特征在于：步驟3)中所述退火為在65℃退火5min。

3.根據權利要求1所述的制備水稻OsPIL15突變體的方法，其特征在于：步驟5)為在除草劑的條件下篩選得到再生苗。

4.根據權利要求3所述的制備水稻OsPIL15突變體的方法，其特征在于：步驟5)為采用抗除草劑基因引物進行篩選；

所用引物為：Bar-F：5′-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3′；

Bar-R：5′-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′。

5.根據權利要求1所述的制備水稻OsPIL15突變體的方法，其特征在于：步驟5)為采用gRNA靶點序列兩側引物進行鑒定；

兩側引物為OsPIL15-test-F：5′-TGTTTTGTGTGTGCAGGTCC-3′；

OsPIL15-test-R：5′-CGGGAGAAGAGCGAGAAGTT-3′。

6.根據權利要求5所述的制備水稻OsPIL15突變體的方法，其特征在于：所述鑒定包括：

A：以轉基因陽性植株DNA為模板，OsPIL15-test-F和OsPIL15-test-R為檢測引物，進行PCR擴增；

B：用SacⅠ酶酶切PCR擴增產物；

C：用電泳分離酶切產物，若電泳結果僅為400bp和273bp兩條帶，為未突變株；否則，為突變株。

7.根據權利要求6所述的制備水稻OsPIL15突變體的方法，其特征在于：將所述轉基因陽性植株的PCR擴增產物測序，確定是雜合體、雙等位突變體、純合突變體或未發生突變單株。

8.根據權利要求1所述制備水稻OsPIL15突變體的方法的應用，其特征在于：所述水稻OsPIL15突變體在水稻育種中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：選擇所述水稻OsPIL15突變體的自交后代中的純合突變體用于水稻種子粒長育種。