[發(fā)明專利]胰島β細胞條件性敲除Tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710380326.5
• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107164406B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱獻軍
• 申請（專利權(quán)）人: 朱獻軍
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 陳劍聰

本發(fā)明公開了一種胰島β細胞條件性敲除Tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，其中構(gòu)建方法包括構(gòu)建Tmem30a基因條件性敲除純合子小鼠，其Tmem30a基因的一個或多個外顯子的兩端插入同向排列的loxP位點，以及將該小鼠與胰島β細胞特異的轉(zhuǎn)基因鼠Ins2?Cre交配，得到胰島β細胞條件性敲除Tmem30a基因的小鼠模型。該胰島β細胞Tmem30a基因條件性敲除小鼠表現(xiàn)出葡萄糖不耐受，胰島素敏感性差，可用作糖尿病研究模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種胰島β細胞條件性敲除Tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

真核細胞細胞膜上的磷脂分子分布是不對稱的。一般情況下磷酸酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)和磷酸酰乙醇胺(Phosphatidyetholanie，PE)分布在細胞的內(nèi)膜，磷酸酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)分步在外膜。真核細胞基因組編碼14個P4型ATPase內(nèi)翻酶來維持這種脂質(zhì)分子的不對稱分布。PS和PE在細胞膜上不對稱分布對重要細胞生理過程如膜穩(wěn)定、血液凝聚反應(yīng)調(diào)控、囊泡蛋白運輸、清除凋亡細胞都至關(guān)重要。ATP8B1,ATP8A2和ATP11C基因突變導(dǎo)致數(shù)種人類疾病，揭示了P型ATP酶的重要性。ATP8B1導(dǎo)致I型漸進式家族性肝內(nèi)膽汁淤積(progressive familial intrahepatic cholestasistype I)和復(fù)發(fā)型肝內(nèi)膽汁淤積。ATP8A2突變導(dǎo)致小腦共濟失調(diào)、智力發(fā)育遲緩和平衡缺乏綜合癥。ATP11C缺失導(dǎo)致B細胞發(fā)育缺陷，貧血和肝內(nèi)膽汁淤積。

P4型ATP酶需要結(jié)合蛋白Tmem30才能正確折疊和運輸。Tmem30和Na-K ATP酶的β亞基作用相似，參與P4型ATP酶的催化反應(yīng)過程。真核生物基因組編碼三個Tmem30蛋白，所以一個Tmem30蛋白需結(jié)合多個P4型ATP酶。Tmem30a廣泛表達在多個組織，在視網(wǎng)膜感光細胞中也特異表達。Tmem30a在人類染色體上定位于6號染色體短臂，由7個外顯子組成，其轉(zhuǎn)錄本大小為2kb，編碼的蛋白大小為44kD，各組織內(nèi)普遍都有表達。

經(jīng)序列分析，Tmem30a在真核生物中高度保守，含有兩個膜錨定區(qū)域，并具有糖基化位點。Tmem30a的體內(nèi)功能還不甚明了，對其研究尚處于初步階段。有必要通過構(gòu)建動物和細胞模型對其功能進行系統(tǒng)的研究。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)病率不斷攀升，已成為嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。DM會引起病人多個器官并發(fā)癥，不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，同時也可導(dǎo)致殘障、死亡。目前對糖尿病的發(fā)病機制了解尚不清楚。合適的糖尿病動物模型，對闡明DM及其并發(fā)癥的發(fā)病機制十分重要。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明利用胰島β細胞Cre轉(zhuǎn)基因鼠，構(gòu)建了Tmem30a胰島β細胞特異敲除小鼠模型，以便研究其在胰島里的功能。

因此，本發(fā)明一方面旨在提供一種胰島β細胞條件性敲除Tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明另一方面旨在提供該胰島β細胞條件性敲除Tmem30a基因小鼠模型用于糖尿病研究。

在第一方面，本發(fā)明提供了一種胰島β細胞條件性敲除Tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)將與小鼠Tmem30a基因同源的5’臂、含有報告基因LacZ的表達框、有NEO抗性基因的表達框、兩端有同向排列l(wèi)oxP位點的第3外顯子和3’端臂克隆到BAC載體以用于替換欲敲除的Tmem30a基因第3個外顯子；

2)利用DNA同源重組技術(shù)將Tmem30a基因中的第3個外顯子替換，得到Tmem30a基因條件性敲除的小鼠胚胎干細胞；

3)利用步驟2)得到的胚胎干細胞制備得到含Tmem30a基因敲除細胞的嵌合體小鼠；