[發明專利]一種高產甘油低產乙酸的葡萄酒用釀酒酵母菌株及構建方法

有效

• 申請號: 201710375649.5
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107177623B
• 公開（公告）日: 2020-01-07
• 發明（設計）人: 梁恒宇;徐農;王凱;李遙力
• 申請（專利權）人: 梁恒宇;武漢生物技術研究院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/04;C12N1/19;C12G1/022;C12P7/20;C12P7/22;C12P7/04;C12R1/865
• 代理公司: 42222 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 彭勁松

1.一種高產甘油低產乙酸的葡萄酒用釀酒酵母菌株，其特征在于，按照以下步驟制備得到：

1）、以釀酒酵母NJZCC17（專利保藏號：CGMCC No. 3284）和NJZSC5（專利保藏號：CGMCCNo. 3732）作為出發菌株，進行單倍體分離，篩選得到兩株單倍體菌株，分別命名為17A24(MATa)單倍體釀酒酵母和5125(MATα)單倍體釀酒酵母；

2）、采用基因敲除技術，利用pUG6質粒對17A24(MATa)單倍體釀酒酵母和5125(MATα)單倍體釀酒酵母的ALD6基因分別進行敲除，所設計的敲除質粒的引物為：

上游引物：

5'-AACATCAAGAAACATCTTTAACATACACAAACACATCTTCGTACGCTGCAGGTC-3'；

下游引物：

5'-TTTGTGTATATGACGGAAAGAAATGCAGGTTGGTACATTAGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'；

PCR擴增體系（50 μL）的組成為：模板DNA 1 μL，10×PCR反應緩沖液（Mg²⁺plus）5.0 μL，10 μM引物（上下游）各1 μL，10mM dNTPs 4 μL，Taq DNA聚合酶5U/μL，ddH₂O37.75 μl，混勻；

PCR擴增條件為：94℃×4 min，一個循環；94℃×30 s, 62℃×30 s，72℃×1 min，30個循環；72℃×10 min，一個循環；

再利用pSH65質粒對兩端帶有loxP位點的G418抗性基因KanMX分別進行敲除；得到基因改良菌株17A24-ald6△(MATa)和5125-ald6△(MATα)；

3）、將基因改良后的17A24-ald6△(MATa)菌株和5125-ald6△(MATα)菌株進行二倍體雜交融合，最后得到新的二倍體雜交菌株NJZ17A5-ald6△(MATa/ MATα)。

2.權利要求1所述的高產甘油低產乙酸的葡萄酒用釀酒酵母菌株在葡萄酒發酵中降低乙酸產量且提高甘油產量的應用。

3.權利要求2所述的高產甘油低產乙酸的葡萄酒用釀酒酵母菌株在葡萄酒發酵中提高異戊醇和2-苯乙醇的產量并降低揮發性物質的產量的應用。