[發(fā)明專利]利用兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解及降溫回收纖維素酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710373912.7
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107177645B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 樓宏銘;蔡誠;邱學青;詹雪娟;楊東杰;龐煜霞
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/02;C12N9/42
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 許菲菲

本發(fā)明公開了利用兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解及降溫回收纖維素酶的方法。該方法將木質(zhì)纖維素加入緩沖溶液中，再加入兩性表面活性劑和纖維素酶，加熱反應(yīng)，得到木質(zhì)纖維素的糖化水解液，通過固液分離后得到酶解液體，再降低酶解液體溫度使兩性表面活性劑和纖維素酶同時沉淀出來進行循環(huán)利用。本發(fā)明方法首次提出了利用兩性表面活性劑具有臨界溶解溫度的特性通過簡單的降溫回收纖維素酶的方法。本發(fā)明方法不僅可以有效地提高木質(zhì)纖維素的酶解效率，回收一定的纖維素酶，而且操作簡單，不需要額外的設(shè)備，綠色環(huán)保，回收的纖維素酶保留了很高的活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及木質(zhì)纖維素酶解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的方法。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素生物煉制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技術(shù)之一。在這一煉制過程中，纖維素酶能否高效酶解木質(zhì)纖維素底物是關(guān)鍵的技術(shù)瓶頸。同時,纖維素酶因其具有活力低、耗量大和價格高等特點,直接阻礙了纖維素乙醇的工業(yè)化。實現(xiàn)纖維素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途徑。目前,纖維素酶回收利用技術(shù)除了超濾膜回收和新鮮底物重吸附法回收。纖維素酶的固定化也是增加酶的穩(wěn)定性減少纖維素酶費用的有效辦法。

研究者們將纖維素酶固定在二氧化矽晶片，二氧化硅，玻璃微珠，海藻酸鈣凝膠珠和磁性納米顆粒上。由于負載的纖維素酶不溶于水，其對可溶性的羧甲基纖維素有較好的水解能力，但是對于真實的木質(zhì)纖維素底物酶解效率較低。為了讓纖維素酶水解效率高且方便回收，具有環(huán)境響應(yīng)(如溫度、pH)的智能高分子成了人們研究的對象，由于調(diào)節(jié)pH過程需要消耗酸和堿，采用具有溫度響應(yīng)的聚合物來回收纖維素酶更加綠色環(huán)保，一些非離子聚合物如聚異丙基丙烯酰胺具有靈敏的溫度響應(yīng)性質(zhì)，將纖維素酶與這些非離子聚合物采用共價鍵結(jié)合在一起，可以使改性后的纖維素酶具有高溫析出和低溫溶解的性質(zhì)。

通過具有酰胺基的甲基丙烯酰胺與N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-異丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)的共聚合成了兩類具有最低臨界溶解溫度(LCST)的共聚物。實驗合成了LCST在20.9-60.5℃范圍內(nèi)的一系列聚合物。將由嗜熱菌Pyrococcushorikoshii產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶通過5-磷酸吡哆醛轉(zhuǎn)氨以產(chǎn)生含酮蛋白質(zhì)，然后將轉(zhuǎn)氨后的纖維素酶與含有酰胺鍵的聚合物共聚合成生物綴合物。在兩次再循環(huán)后內(nèi)切葡聚糖酶保持了60％以上的活性，并且與單獨的未修飾的酶相比可以產(chǎn)生更多的可溶性糖(Journal of the AmericanChemical Society,2013,135:293-300.)。

通過N-異丙基甲基丙烯酰胺(NIPMA)與丙烯酸甲酯和N-(羥甲基)丙烯酰胺的聚合而成的熱響應(yīng)聚合物(PNMN)用于與纖維素酶以形成生物綴合物。通過小分子猝滅，調(diào)節(jié)聚合物(PNMN)的LCST為51.6℃，此時回收率為98.5％，通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺將纖維素酶共價結(jié)合到PNMN合成生物綴合物(PNMN-C)，聚合物-纖維素酶生物綴合物在重復(fù)5次水解反應(yīng)循環(huán)后依然保持了其初始活性的85.2％(Journal of MolecularCatalysis B:Enzymatic,2016,128:39-45.)。

但是溫敏性高分子負載纖維素酶仍然面臨著一些問題：1、在較高的溫度下回收纖維素酶，纖維素酶容易失活；2、將纖維素酶接枝在聚合物上時纖維素酶容易失活，3、纖維素酶是個多組分的酶系，其接枝反應(yīng)和回收率不盡相同，回收影響酶系的活性。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種能耗少，綠色環(huán)保，只需要自然或通過制冷設(shè)備降低酶解液體的溫度就可以回收纖維素酶的利用兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解并通過降溫來回收纖維素酶的方法。

本發(fā)明兩性表面活性劑需要具備適當?shù)呐R界溶解溫度(UCST)，使其在酶解溫度下40～60℃完全溶解在緩沖液中，酶解結(jié)束后，可以通過降溫的方法從酶解液體中沉淀出來。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：