[發(fā)明專利]檢測人EGFR基因21L858R點突變的智能恒溫擴增引物組、檢測試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710373391.5
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107299131A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉蕾;劉雪美;閆鶴;石磊;陳洵;常彥磊
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司44202
• 代理人: 王會龍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于智能恒溫擴增技術(shù)檢測人 EGFR基因21L858R點突變的引物組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

近年來，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的發(fā)病率逐年增高，嚴重威脅著人類的健康。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑改變了NSCLC患者的治療策略。EGFR突變是該類藥物的預(yù)測因子，在NSCLC的治療決策中起重要作用。人表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子21L858R發(fā)生突變的非小細胞肺癌患者，對酪氨酸激酶抑制劑類藥物敏感，即受體酪氨酸激酶抑制劑藥物對這些患者有療效。外顯子 21上的L858R點突變通常是替代突變，2573位的T由G取代，導(dǎo)致EGFR第 858位框架氨基酸由亮氨酸變?yōu)榫彼?CTG—CGG)。因此EGFR外顯子 21L858R點突變的檢測，可以為篩選靶向治療患者提供參考；同時可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復(fù)發(fā)監(jiān)測，以及用藥期間耐藥性突變監(jiān)測。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了眾多以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的EGFR突變檢測方法，如熒光定量PCR、DNA探針、DNA芯片、DNA直接測序等，以其高效、特異等優(yōu)點而受到青睞；但這些檢測技術(shù)對檢測人員技術(shù)水平要求高，并且這些技術(shù)需要的檢測儀器昂貴、檢測周期長，難以實現(xiàn)快速檢測和臨床推廣的目的。所以，在臨床檢測和科學(xué)研究實踐中均需要一種降低操作技術(shù)和費用、快速簡便、容易普及、安全可靠的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測人EGFR基因 21L858R點突變的智能恒溫擴增引物組。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題還在于提供一種檢測人EGFR基因21L858R點突變智能恒溫擴增檢測試劑盒。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題還在于提供一種檢測人EGFR基因21L858R點突變的智能恒溫擴增檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明公開了一種檢測人EGFR基因21L858R點突變的智能恒溫擴增檢測引物組，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分別如下所示：

TP引物：CCTATCGGCATAGGATCACAGATTTGGGCG；

FP引物：GCTGGGTGCGCTCCTTACTTTGCCTCCTTC；

BP引物：AAGAGAAAGAATACCATGC；

OP1引物：AAACACCGCAGCATGTC；

OP2引物：CTGGCTGACCTAAAGCC。

優(yōu)選地，擴增反應(yīng)時，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩爾比為：8：8：4：1：1。

另一方面，本發(fā)明還公開了一種檢測人EGFR基因21L858R點突變的智能恒溫擴增檢測試劑盒，該檢測試劑盒中含有上述方案中所列的智能恒溫擴增引物組。

優(yōu)選地，該智能恒溫擴增檢測試劑盒還包括以下成分的部分或者全部：(1) DNA聚合酶；(2)錯配結(jié)合蛋白；(3)智能恒溫擴增反應(yīng)液；(4)熒光顯色劑； (5)陽性對照和陰性對照。

優(yōu)選地，該智能恒溫擴增檢測試劑盒中，其引物中TP引物、FP引物、BP 引物、OP1引物和OP2引物的摩爾比為：8：8：4：1：1。

優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶；所述錯配結(jié)合蛋白為Tap Muts 錯配結(jié)合蛋白。

優(yōu)選地，所述智能恒溫擴增反應(yīng)液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。

優(yōu)選地，陽性對照為含有檢測人EGFR基因外顯子21L858R突變點基因片段的T載體克隆，陰性對照為不含人EGFR基因外顯子21L858R突變點基因片段的水或其他溶劑。更優(yōu)地，陰性對照為去離子水。

優(yōu)選地，所述顯色劑為1/50000原液稀釋的Green I。

再有，本發(fā)明還公開了一種檢測人EGFR基因21L858R點突變的智能恒溫擴增檢測方法，包括如下步驟：

(1)待檢樣品DNA的提取；

(2)智能恒溫擴增反應(yīng)：將步驟(1)中提取的待檢樣品DNA加入智能恒溫擴增反應(yīng)體系中，混勻后離心，并于63℃反應(yīng)40min；該智能恒溫擴增反應(yīng)體系中含有上述方案中所述的智能恒溫擴增引物組；