[發明專利]生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品及其制備方法

在審

• 申請號: 201710373218.5
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107190045A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 盧行安;徐大軍;李宏;趙紅陽;王秀君;劉漢霞;王偉;陳若晞
• 申請（專利權）人: 中檢科（北京）實驗室能力評價有限公司
• 主分類號: C12Q1/10
• 分類號: C12Q1/10;C12Q1/06;C12Q1/24
• 代理公司: 大連博晟專利代理事務所(特殊普通合伙)21236
• 代理人: 于忠晶

技術領域

本發明屬于微生物學檢測方面的質量控制領域，特別涉及一種生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品及其制備方法。

背景技術

生活飲用水微生物學檢驗領域非常特殊。目前，雖然國內外已有認可機構組織生活飲用水微生物學能力驗證和大規模的制備微生物能力驗證樣品的先例，但多為總大腸菌群定性樣品或純菌株，但總大腸菌群定量檢測樣品制備難度較高，，尚無一種較好的制備方法，均勻性和穩定性無法達到要求總大腸菌群即總大腸菌群標準樣品仍屬空白領域。

總大腸菌群并非細菌學分類命名，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化特征及血清學方面并非完全一致，其定義為：在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧或兼性厭氧菌的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌和產氣腸桿菌等。如果制備的總大腸菌群樣品中，目標菌群易發生變化(繁殖和死亡等)，就會導致樣品的保存期短，樣品的均勻性和穩定性差。因此，綜合考慮細菌的生化特性，選取性質相對穩定的菌群作為目標菌群對保證樣品的均勻性和穩定性十分重要。總大腸菌群樣品制備的工藝技術要求比較高，并且樣品的均勻性和穩定性與凍干的菌種、凍干的工藝條件、凍干保護劑的使用、再水化的介質等均有密切的關系。

生活飲用水中總大腸菌群指標，直接反映著生活飲用水的衛生質量與潛在致病風險。如果總大腸菌群數超過一定限量，就加大了致病性大腸埃希氏菌的存在風險，并最終導致食源性疾病發生。因此，制備均勻性與穩定性俱佳的總大腸菌群樣品，可以避免總大腸菌群檢驗的隨意性和不確定性，真實地反映檢測實驗室的能力。這對提高實驗室質量控制水平，保障生活飲用水安全，甚至于打破國際貿易壁壘、提高我國生活飲用水國際競爭力都具有特殊重要的意義。

發明內容

本發明的目的是克服總大腸菌群測定樣品中總的活的細菌數目在運輸、儲存和測試等過程中菌落數都可發生變化的問題，提供一種生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品，均勻性、穩定性符合能力驗證要求，本發明的另一個目的是提供該樣品的制備方法，工藝簡單，成功率高。

本發明為實現上述目的所采用的技術方案是：生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品，其特征是：包括目標菌群和背景菌群，所述目標菌群由大腸埃希氏菌(E.coil)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pnenmoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、奇異變形桿菌 (Proteus mirabilis)和產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)組成，所述背景菌群由金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)組成。

所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質，其中海藻糖體積分數為12％、脫脂奶粉體積分數為0.1％。

所述樣品中目標菌群的目標濃度為10²～10³CFU/100mL，背景菌群的目標濃度為10² CFU/mL。

一種生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品的制備方法，其特征是：包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩定性試驗四個步驟，其中樣品凍干過程為：菌株復蘇傳代—增菌—菌懸液配制—凍干和包裝—儲存，具體過程為：

(1)菌株復蘇傳代

將標準菌株接種到營養瓊脂斜面培養基中，在36±1℃下使其復蘇和生長，并對復蘇的菌株進行鑒定；

(2)增菌

目標菌群培養至對數生長期末，背景菌群培養至穩定期，從斜面刮取菌落，加到少量的凍干保護劑中制成相應單一菌種的菌液；

(3)菌懸液配制

將上一過程得到的菌液與凍干保護劑混合，按目標菌群的目標濃度10²～10³CFU/100mL和背景菌群的目標濃度10²CFU/mL配制菌懸液，分別配制5個目標菌的菌懸液和2個背景菌的菌懸液，分別按1:1體積比混合形成目標菌群懸液和背景菌群懸液，再將目標菌群懸液與背景菌群懸液按1:1體積比混合，得到混合菌懸液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌下分裝到樣品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實；

(4)凍干和包裝

將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機中，冷凍干燥40～50h，當樣品冷凍干燥結束后，直接進行箱內加塞，關閉機器，樣品瓶中樣品為真空狀態；

(5)儲存