[發明專利]用轉基因斑馬魚檢測具乙酰膽堿酯酶抑制活性物質的方法

在審

• 申請號: 201710372585.3
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107164405A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 楊立新;曾晨;趙秀閣
• 申請（專利權）人: 中國環境科學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;A01K67/027;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,張立娜

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用轉基因斑馬魚檢測具乙酰膽堿酯酶抑制活性物質的方法。

背景技術

乙酰膽堿酯酶是降解乙酰膽堿的水解酶。乙酰膽堿酯酶存在于神經傳導組織和紅細胞膜，在神經細胞突觸和神經肌肉接點-運動終板的發育過程中具有重要作用。乙酰膽堿酯酶抑制劑通過抑制乙酰膽堿水解酶活性阻斷神經之間，神經和肌肉間的信號傳遞，影響神經和運動功能并導致動物癱瘓和死亡。乙酰膽堿酯酶抑制劑被廣泛應用于治療阿爾茨海默病、神經毒劑和殺蟲劑(沙林、VX毒氣、有機磷和氨基甲酸類農藥等)。由于有機磷農藥具有毒性強、毒性效應廣、在環境中可快速降解等特點，被廣泛應用于農業生產和作為室內外殺蟲劑。有機磷和氨基甲酸類農藥的廣泛使用對食物、水和土壤的污染引起了公眾對健康影響的關注，對生態環境安全的擔憂。評價乙酰膽堿酯酶抑制劑類物質對人類健康和環境的影響效應，研究、發明特異性好，高效的檢測乙酰膽堿酯酶抑制劑類物質的方法和技術成為關鍵。

檢測環境中乙酰膽堿酯酶抑制劑的水平已經被廣泛用做土壤、水環境中有機磷農藥的動物暴露水平和導致動物生理效應的評價指標。分析化學技術雖然可以分析、辨別目前食物、生物和環境樣品中多數有機磷和氨基甲酸類化學物質，但是這些技術需要特殊的分析儀器和專業人員，限制了其應用范圍。同時絕大多數有機磷類農藥在環境中快速降解，經過幾小時或者數天后有機磷農藥的濃度會低于儀器的檢測限，直接影響分析結果。檢測乙酰膽堿酯酶活性的電化學裝置不但需要制備靈敏性高的乙酰膽堿酯酶，而且乙酰膽堿酯酶抑制劑會導致感應器中乙酰膽堿酯酶活性的不可逆性抑制，影響電化學感應器的重復使用?；诩毎钚缘臋z測方法具有快速、敏感性高的特點，但是不能反映乙酰膽堿酯酶抑制劑在生物體內代謝的相關信息，同時細胞對不同類型的化學物質的生物學效應具有相似性，直接影響乙酰膽堿酯酶抑制劑檢測的特異性。

斑馬魚具有個體小、養殖費用低、生長周期短、產卵量大、胚胎透明和體外發育等優點，被廣泛用于遺傳、發育、環境毒理和人類疾病等方面的研究。用斑馬魚評價環境化學污染物的毒性效應的標準方法已經建立并得到廣泛應用(OECD 203,OECD 236,ISO 7346)，但是這些標準方法檢測污染物毒性效應的敏感性較低，特異性不高。通過基因重組技術，構建表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚已經被廣泛應用于研究發育過程中基因調控，藥物的作用位點和安全性評價等領域。表達熒光蛋白的轉基因魚不但能用于研究化學物質誘導的靶基因的表達活性，還可以半定量分析化學物質在組織和器官的累積量，為化學物質毒性的生物學效應評價提供了一種敏感性高，重復性和特異性好的方法。一些對環境中一種或者一類化學物質敏感性高，特異性強的表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚已經被用于評價環境中重金屬和有機化學污染物的毒性效應和機理研究。目前所有構建的轉基因魚不能或不適合用于檢測環境樣品中具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用轉基因斑馬魚檢測具乙酰膽堿酯酶抑制活性物質的方法。

首先，本發明提供了一種利用轉基因斑馬魚檢測待測物質是否為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質的方法。

本發明所提供的利用轉基因斑馬魚檢測待測物質是否為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質的方法，具體可包括如下步驟：

(A1)向轉基因斑馬魚的培養體系中加入不同濃度的待測物質，使培養體系中所述待測物質的濃度呈現一定的濃度梯度，經過24-72小時(如44-48小時)暴露，檢測所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值，記錄經不同濃度的所述待測物質暴露誘導的轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值；

所述轉基因斑馬魚為轉基因斑馬魚A或轉基因斑馬魚B；

所述轉基因斑馬魚A為向受體斑馬魚中轉入修飾后的BAC DNA，經過同源重組后得到的；所述修飾后的BAC DNA是將斑馬魚BAC DNA中的hspb11基因的外顯子部分替換為含有熒光蛋白編碼基因的片段后得到的；

所述轉基因斑馬魚B為向受體斑馬魚中轉入含有目的DNA片段的重組質粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游調控序列、熒光蛋白編碼基因及抗性篩選標記基因；

(A2)如果經過不同濃度的所述待測物質暴露后，存在至少一個濃度使得所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值顯著高于本底值，則所述待測物質為或候選為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質；反之，則所述待測物質不為或候選不為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質；