[發明專利]志賀氏菌的IC?LAMP檢測引物組及其應用

在審

• 申請號: 201710371292.3
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107164475A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 張金陽;張立定;韋秋獎;宋玉竹;夏雪山;韓芹芹;陳強
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N33/543;C12R1/01
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于志賀氏菌檢測的引物組、試劑盒和志賀氏菌的IC-LAMP檢測方法。

背景技術

志賀氏菌為革蘭陰性桿菌，是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌。志賀菌可穿入低位腸段的粘膜，引起粘液分泌、充血、白細胞浸潤、水腫，并常有表淺粘膜潰瘍。急性典型菌痢癥狀，有腹痛腹瀉、膿血粘便、里急后重、發熱等呈現嚴重的全身中毒癥狀。

志賀菌屬是主要的腸道病原菌之一，也是引起人類細菌性痢疾的病原體。本屬細菌分布于全世界，是炎癥性痢疾的典型病原菌，很多地區5%~10%的腹瀉性疾病是由該菌屬所致。弗氏志賀菌和宋內志賀菌比鮑氏志賀菌和毒力特別強的痢疾志賀菌分布更廣。志賀菌廣泛存在于食品中，大量食入，會引起嚴重后果。因此，快速準確地檢測出志賀氏菌就顯得尤為重要。

目前臨床應用的志賀氏菌的檢測方法包括細菌分離鑒定、免疫學方法、分子生物學檢測方法等，但這些方法都存在一些缺陷。傳統的檢測方法主要采用細菌前增菌培養、分離培養、菌落形態觀察和一系列的生化鑒定以及血清型鑒定等步驟，一般需4至7天，此方法培養時間長、工作量大、實驗步驟繁瑣，在很多突發事件中不能及時反映準確的數據。免疫學方法易污染，且交叉反應比較嚴重、假陽性多、靈敏度偏低。常規 PCR 方法檢測其靈敏度低，檢測時間長，需要昂貴的PCR儀器以及電泳儀、凝膠成像儀等配套儀器并且在檢測前還需要進行菌體的富集，DNA的提取。免疫磁分離技術是將特異性抗體與一定大小的磁珠偶聯，利用特異性抗體能與細胞表面抗原相結合的原理，將磁球與細胞結合，在外磁場的作用下，將磁球-細胞復合物從環境中分離出來，達到獲取目標細胞的一項技術，但是單獨使用該技術時只能實現分離，還需結合其他手段進行檢測，而目前使用免疫磁分離技術進行分離的檢測方法的靈敏度仍有待提高。

發明內容

本發明目的在于提供了一種用于檢測志賀氏菌的IC-LAMP特異性引物組，它包括正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，各引物序列如下：

FIP:5'-CTGTCGAAGCTCCGCAGAGGTTTTGGATTCCGTGAACAGGTCG-3'；（如SEO ID NO：1所示）

BIP:5'-CTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCTTTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3'；（如SEO ID NO：2所示）

F3: 5' -ATACCGTCTCTGCACGCA-3'；（如SEO ID NO：3所示）

B3: 5' -GCCTTCTGATGCCTGATGG-3'；（如SEO ID NO：4所示）。

本發明另一目的是提供一種志賀氏菌的IC-LAMP檢測試劑盒，其包括權利要求1所述的志賀氏菌的IC-LAMP檢測引物組和結合有志賀氏菌特異抗體的Protein A/G偶聯磁珠。

其中結合有志賀氏菌特異抗體的Protein A/G親和磁珠是采用Protein A/G可以特異性的與抗體Fc段結合的原理制備的，具體參考Protein A/G免疫沉淀磁珠（美國Biotool，貨號：B23202）產品說明書所述方法制得。

本發明試劑盒還包括常規LAMP檢測中所需的常規試劑，例如2×isothermal mastermix、無核酸酶水。

本發明將環介導等溫擴增技術（LAMP )與免疫磁珠相結合，針對志賀氏菌重要的毒性基因ipaH基因設計一套引物，優化反應條件，建立志賀氏菌IC-LAMP檢測技術。

本發明另一目的是提供了一種志賀氏菌檢測的新方法，利用Protein A/G免疫沉淀磁珠與志賀氏菌的多克隆抗體偶聯形成免疫磁珠去捕捉樣品中的志賀氏菌，然后通過直接裂解法獲得基因組，通過環介導等溫擴增，確認是否存在有志賀氏菌擴增產物。

所述的待測樣品可以是被志賀氏菌污染的水、食品及人和動物的糞便及咽拭子/肛拭子等。

檢測方法具體步驟如下：

（1）待測樣品的制備，將待測樣品用已經滅菌的LB液體培養基進行稀釋；

（2）在待測樣品中添加結合有志賀氏菌特異抗體的Protein A/G偶聯磁珠，混勻后進行磁性分離，棄上清液，然后加入PBS-T溶液重懸后再進行磁性分離，重復2-3次；

（3）采用直接裂解法裂解步驟（2）中捕獲菌體的基因組DNA，即在步驟（2）獲得的磁珠-抗體-抗原的復合物中加入裂解液進行裂解，然后加入終止液終止反應；