[發(fā)明專利]用于H7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710369843.2
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107142335A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹琛福;賈偉新;廖明;林彥星;謝淑敏;黃超華
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司44281
• 代理人: 彭家恩

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及禽流感病毒檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種用于H7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬中的禽流感病毒引起的發(fā)生于各種家禽和野禽的病毒性傳染病。該病于1978年在意大利雞群中首次暴發(fā)，現(xiàn)已遍布世界許多國家。由于不同禽流感病毒的HA和NA有不同的抗原性，目前已發(fā)現(xiàn)有16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型，此外，還從蝙蝠體內(nèi)分離到了兩種新的A型流感病毒亞型，H17N10和H18N11。根據(jù)禽流感病毒對人工感染雞的致病性，可將其分為高致病性禽流感(縮寫HPAIV)和低致病力禽流感(縮寫LPAIV)，病毒HA裂解位點(diǎn)的分子標(biāo)準(zhǔn)也可作為致病性的補(bǔ)充依據(jù)。目前所有的高致病性禽流感病毒都屬于H5或H7亞型，低致病性禽流感病毒以H9N2亞型居多。H7N9亞型禽流感病毒是一種新型禽流感病毒，可感染禽和人。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告統(tǒng)計(jì)，自2013年3月中國首次報(bào)道人感染H7N9亞型禽流感以來，截止到2017年2月14日，共有1223例人感染H7N9亞型禽流感實(shí)驗(yàn)室確診病例，包括至少380名死亡病例。2016年入冬以來，我國出現(xiàn)人感染該亞型病毒病例數(shù)直線上升的情況，特別是2016年12月的最后兩周，全國新增人間病例92例，死亡10例，這說明該亞型病毒對人的健康威脅仍然很大。活禽零售市場環(huán)境污染率與人感染病例數(shù)在時(shí)空維度表現(xiàn)一致，即隨著污染水平升高，人的感染風(fēng)險(xiǎn)也增加。值得關(guān)注的是，2015年-2016年間報(bào)告人感染病例數(shù)位居前列的廣東、浙江、江蘇、福建等省份市也已在養(yǎng)雞場中發(fā)現(xiàn)H7N9亞型禽流感病毒。雖然目前只是散發(fā)，但對其流行態(tài)勢要高度關(guān)注。

重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增技術(shù)RPA(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)，RPA能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行37℃-42℃常溫下的單分子核酸檢測。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，其擴(kuò)增原理是：重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。目前尚沒有H7亞型禽流感病毒的RPA檢測研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本申請的目的是提供一種用于H7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應(yīng)用。

本申請采用了以下技術(shù)方案：

本申請的一方面公開了一種用于H7亞型禽流感病毒檢測的試劑，該試劑包括引物對和探針，引物對的上游引物為Seq ID No.1所示序列，引物對的下游引物為Seq ID No.2所示序列，探針為Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互補(bǔ)序列；

Seq ID No.1：5’-GCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTC-3’

Seq ID No.2：5’-GCATTCTGGTGTCTGAAACCATACCAACCATC-3’

Seq ID No.3：

5’-GGGAAGAGGCCTATTTGGTGCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGA TGGGAA-3’

Seq ID No.3所示序列的探針中，第32個(gè)堿基修飾BHQ1-dT、第36個(gè)堿基修飾6-FAM-dT、第34個(gè)堿基替換為dSpacer、3’端修飾C3Spacer。

需要說明的是，在熒光檢測中，探針是特異性的結(jié)合到雙鏈的其中一條鏈的，只要PCR擴(kuò)增的時(shí)候，將結(jié)合的探針破壞，即可產(chǎn)生熒光信號，因此，可以采用Seq ID No.3所示序列的探針結(jié)合到其中一條鏈上，也可以采用Seq ID No.3所示序列的反向互補(bǔ)序列作為探針結(jié)合到另一條鏈上，探針的修飾方式不變。