[發(fā)明專利]一種大規(guī)模篩選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710369577.3
• 申請(qǐng)日: 2017-05-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108956791B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛峰;楊明坤;張珈;熊倩;洪斌;李俊峰;劉光猛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北普羅金科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

1.一種大規(guī)模篩選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）將生物組織對(duì)照樣本和參考樣本勻漿、裂解；

（2）取上述蛋白質(zhì)提取液用點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣并分別固定在96孔板中反應(yīng)1小時(shí)；將板用含有脫脂奶的溶液封閉，將孔板中的物質(zhì)取出，用玻璃棒碎膠，用緩沖液溶解和浸泡過(guò)夜，離心后取上清液濃縮，將濃縮液用超聲波輔助酶解15s，將酶解液用0.45μm濾膜過(guò)濾；其中采用緩沖液為0.25-0.3%溴酚藍(lán)溶液：0.25-0.3%二甲苯青FF：40%蔗糖水溶液=15-25:15:60-70；

（3）將步驟（2）的濾液用LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；

液相色譜條件為：色譜柱為MONO-Q柱；進(jìn)樣量10μL；

流動(dòng)相A為10mmol/L的NaOH，流動(dòng)相B為：10mmol/L的NaOH+1.8mol/L的NaCl；梯度為0-5min，0%B,5-23min，0-80%B,23-35min，100%B，流速：0.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)UV230nm檢測(cè)；

質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)設(shè)置為：質(zhì)荷比范圍400-5000，步長(zhǎng)0.25，掃描時(shí)間6s，低OR電壓35V，高OR電壓100V；其它參數(shù)設(shè)置均按照PPG校正儀器后的參數(shù)設(shè)置；

（4）采用label free定量方法以MS1和MS2質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；通過(guò)比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強(qiáng)度，分析樣品蛋白質(zhì)的豐度變化，以MS1為基礎(chǔ)，計(jì)算每個(gè)肽段的信號(hào)強(qiáng)度在LC-MS上的積分，以MS2的鑒定結(jié)果為定量基礎(chǔ)，大規(guī)模對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行修正；

（5）通過(guò)修正的數(shù)據(jù)分析結(jié)果篩選出顯著上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大規(guī)模篩選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的方法，其特征在于，步驟(1)將所述對(duì)照樣本和參考樣本混合，不需用同位素或其他標(biāo)簽進(jìn)行任何體內(nèi)或體外標(biāo)記。