[發明專利]抗體捕獲蛋白及報告基因融合重組蛋白檢測抗體的方法

在審

• 申請號: 201710369057.2
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107290523A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 南雨辰;周恩民;武春燕
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/68
• 代理公司: 西安長和專利代理有限公司61227
• 代理人: 黃偉洪

技術領域

本發明屬于抗體檢測技術領域，尤其涉及一種抗體捕獲蛋白及報告基因融合重組蛋白檢測抗體的方法。

背景技術

酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是目前現有最常用的抗體檢測技術，其基本方法是將已知的抗原吸附于固相載體(聚苯乙烯微量反應板)表面，通過固相載體表面的抗原與待檢測抗體的結合；再加入酶標記的二抗(針對不同的種屬，人，猴，小鼠)來進一步識別與抗原結合的抗體，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行；再加入底物后二抗上標記的酶基團介導一個顏色反應，通過分光光度計讀取吸光度后即可獲得讀數，以此判斷樣品中是否存在識別吸附于固相載體表面抗原的抗體。通過酶聯免疫法(ELISA)方法來進行抗體檢測有以下幾個缺點：1.用于檢測用的重組抗原需要在細菌或其他重組蛋白表達系統中進行表達，然后進行純化才可用于包被聚苯乙烯板的固相表面，因此難以應用于一些疏水性較強，或具有多次跨膜結構的抗原表達純化，導致難以開發出相應抗體的檢測方法2.需要通過化學偶聯的方式，將報告基因蛋白(如辣根過氧化物酶)偶聯標記至重組抗原或抗體上形成酶標抗原或者酶標抗體進行檢測，而化學偶聯的方式將增加額外的生產步驟和生產成本，同時可能由于所發生化學偶聯反應而影響抗原與抗體的結合。3.酶聯免疫吸附法一般需使用特定的抗原或者抗體來吸附于檢測用的聚苯乙烯板的固相表面，針對不同抗原的檢測試劑盒需要使用相應的抗原或者抗體來預先吸附聚苯乙烯板，不同試劑盒之間不能共用，因此包被聚丙乙烯板工作繁瑣。4.針對不同物種來源的檢測血清樣本(如人，鼠，猴，豬，雞)，需要針對性的使用不同物種抗體的二抗，導致所開發的試劑盒具有種屬特異性無法無差別應針對同一抗原但來源于不同物種抗體的檢測(如雞的禽流感抗體檢測試劑盒無法應用于人的禽流感抗體檢測)。

綜上所述，現有技術存在的問題是：針對同一種抗原的ELISA試劑盒無法應用與不同的動物(即種屬特異性)，對于某些特定的跨膜抗原因無法表達純化，因此無法開發出酶聯免疫法的抗體檢測試劑盒。現有的酶聯免疫法所使用的重組抗原純化過程及與酶進行偶聯的過程繁瑣，且可能對抗原或抗體存在影響。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種抗體捕獲蛋白及報告基因融合重組蛋白檢測抗體的方法。

本發明是這樣實現的，一種抗體捕獲蛋白及報告基因融合重組蛋白檢測抗體的方法，所述抗體捕獲蛋白及報告基因融合重組蛋白檢測抗體的方法通過蛋白質工程的手段將報告基因的編碼核酸序列直接與抗原編碼核酸的序列通過基因工程改造的方式連接為一個單一的重組基因，再通過化學轉染或電轉染等方式導入真核或原核細胞并表達為一個重組蛋白(即酶融合抗原)；直接使用表達酶融合抗原的細胞或真核或原核裂解物作為檢測用抗原；使用抗體捕獲蛋白包被聚苯乙烯板。

進一步，所述抗體捕獲蛋白包括：鏈球菌蛋白A，蛋白G，重組蛋白A/G，蛋白L或以抗體作為免疫原刺激動物產生針對抗體的普通二抗。

進一步，所述抗體捕獲蛋白及報告基因融合重組蛋白檢測抗體的方法包括以下步驟：

步驟一，使用抗體捕獲蛋白包被檢測板的固象表面(聚苯乙烯板或具有蛋白吸附能力的材料)；

步驟二，使用抗體捕獲蛋白吸附與載體固相表面后，使用無關蛋白進行封閉，將檢測板固相表面上未吸附抗體捕獲蛋白的表面進行封閉從而避免非特異性吸附的產生；

步驟三，將報告基因的核酸序列與抗原(或抗原表位)編碼基因的核酸序列通過分子克隆的方式連接為一個單一的核酸序列，使報告基因和抗原(抗原表位)表達為一個單一的融合重組蛋白(即酶融合重組抗原)作為檢測用抗原使用；

步驟四，將表達報告基因融合重組抗原(酶融合抗原)的細胞使用適當的方法破碎裂解，部分原核細胞難以表達的蛋白可使用真核細胞表達系統進行表達；

步驟五，將待檢測樣本以1:20的比例加入含有重組抗原的裂解液中混合后，加入抗體捕獲蛋白包被，無關蛋白封閉的檢測板的孔中進行孵育；

步驟六，樣本中所有抗體首先被抗體捕獲蛋白所捕獲吸附與檢測板的固象表面，吸附于固相表面的抗體中若含有可識別重組酶融合抗原的抗體，則可捕獲細胞裂解液中攜帶報告基因的重組酶融合抗原；

步驟七，通過洗滌法去除液相中未被抗體識別的重組酶融合抗原及細胞裂解物，加入酶融合抗原上的報告基因(即酶活性基團)所識別的底物進行反應，通過檢測報告基因的活性，確認樣本中是否含有針對重組蛋白的抗體。