[發明專利]編碼組織型纖溶酶原激活劑的DNA分子及其重組細胞株

有效

• 申請號: 201710367902.2
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107177611B
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發明（設計）人: 薛劍峰;張淼;康濤;鐘正明
• 申請（專利權）人: 江蘇康禾生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/48;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

本發明提供了一種編碼組織型纖溶酶原激活劑的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發明還提供了一種包含本發明的DNA分子的表達載體和用于表達組織型纖溶酶原激活劑的CHO細胞株。本發明的提供的編碼組織型纖溶酶原激活劑的DNA分子經過優化，更有利于哺乳動物細胞表達。本發明提供的表達組織型纖溶酶原激活劑的CHO細胞株極大地提高了表達效率，從而降低了生產和使用成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及編碼組織型纖溶酶原激活劑的DNA分子，本發明還涉及包含該DNA分子的載體以及其重組細胞株。

背景技術

組織型纖溶酶原激活劑(Tissue-type plaminogen activator，tPA)由血管內皮細胞合成并分泌的一種糖蛋白，是血液內纖溶系統的生理性激活劑。在血栓形成時，能特異與血栓中的纖維蛋白結合，并與纖溶酶原形成三元復合物，在血栓處激活纖溶酶原，達到局部溶栓的效果。基于這一特性，美國Genentech公司開發了重組人tPA并于1987年上市，通用名為阿替普酶(Actilyse)。作為一種高效特異的溶血栓藥，阿替普酶用于心肌梗死、腦血栓等血栓性疾病的搶救和治療。阿替普酶采用CHO細胞重組表達，具有與天然tPA相同的生物學活性，對血栓中的纖維蛋白有很高的親和性，而對血液中的纖維蛋白原、凝血因子等沒有作用，這就避免了由于激活全身纖溶系統所帶來的潛在出血危險。重組表達的阿替普酶與天然tPA序列一致，臨床應用不會產生免疫反應等副作用。因此，療效好、安全性高、溶栓后再凝趨勢弱及便于搶救等是該藥的最大優點。

但是，阿替普酶在血液中可以被I型纖溶酶原激活劑抑制物快速、特異地結合，從而失去溶栓活性，也可以與肝細胞、血管內皮細胞上的特異性受體結合而被吞噬和從血液中清除。這一缺點使得其在血液中的半衰期非常短，僅3-6分鐘，這也導致阿替普酶臨床應用劑量大(最大劑量達90mg)、費用昂貴。為了改變這一缺陷，主要從兩方面進行改善：一是延長半衰期，主要是通過構建tPA的突變體，增強其活性或者降低與I型纖溶酶原激活劑抑制物及受體的親和力實現，如德國Boehringer Mannheim公司開發的瑞替普酶、美國Genentech公司的TNK酶、美國Bristol-Myers Squibb公司開發的mPA酶、日本Eisai公司開發的孟替普酶等。二是優化tPA的生產工藝，通過改變表達系統、簡化純化步驟等提高生產率。例如，中國發明專利CN1314490公開了在酵母菌中分泌表達人組織纖溶酶原激活劑(htPA)及其活性測定方法。在獲得htPA cDNA的基礎上，對該基因5’端加以修飾，使其正確插入pPIC9載體的α因子信號肽序列下游，經轉化構建陽性工程菌，然而酵母菌表達系統的糖基化形式與哺乳動物細胞存在一定的差異，這些差異將直接影響重組蛋白的活性、穩定性及免疫原性。

中國發明專利CN101085978公開了一種用于動物細胞灌流培養的過濾-沉降雙結合灌流系統，通過改造灌流培養系統的方式提高CHO細胞密度和產量。中國發明專利CN101096655公開了一種采用CYTOPORE多孔微載體培養法生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的方法，將TNK-TPA基因工程CHO細胞株加培養基重新懸浮后，使用CYTOPORE多孔微載體培養TNK-TPA基因工程細胞生產TNK-TPA。中國發明專利CN1786161將含天然或改構的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品過親和層析柱，通過特異的仿生親和分離材料提高tPA的純化收率等。

以上的研究多側重于培養和純化工藝方面的改進，而上游工藝特別是表達細胞株的設計和優化卻鮮有報道。然而，當前生產重組tPA及其突變體的方法涉及的環節眾多，是一項復雜的系統工程，而對細胞株構建的過程，如啟動子的選擇、目的基因的序列、篩選標記的選擇等進行深入研究，將更有效地提高tPA的生產效率、并進一步地降低生產成本和使用成本。

基于此，當前對大規模生產重組tPA的高效率、低成本的方法存在需求。

發明內容