[發明專利]基于POCKITMicro熒光PCR平臺的禽流感病毒N9亞型檢測試劑及應用

在審

• 申請號: 201710366879.5
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107312871A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 岳華;黃建德;萬紅珍
• 申請（專利權）人: 金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司;北京華安瑞基生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京冠和權律師事務所11399
• 代理人: 朱健,陳國軍

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的禽流感病毒N9亞型檢測試劑及應用，本發明還涉及針對禽流感病毒N9亞型的檢測試劑盒及檢測系統。

背景技術

禽流感(Avian Influenza)是禽流行性感冒的簡稱，它是由禽流感病毒引起的一種禽類急性傳染病，被國際獸疫局定為甲類傳染病。通常禽流感只在禽類之間感染和傳播，但有時也能感染人類，自1997年香港首次發現人感染禽流感以來，全球多地均報告了人禽流感病例，病死率約60％。雖然禽流感被發現已逾百年，但至今人類并未掌握特異性的預防和治療方法，僅能以消毒、隔離、大量宰殺禽畜的方法防止其蔓延。因此，禽流感目前已成為一個重大的公共安全問題，在給禽類和人類健康帶來嚴重威脅的同時，也給社會造成了巨大的經濟損失。

禽流感病毒(AIV)屬于正粘病毒科的甲型流感病毒，多為球形，直徑80～120nm，有囊膜，病毒表面有10～12nm的密集釘狀物或纖突覆蓋，病毒囊膜內有螺旋形核衣殼。禽流感病毒基因組由8個負鏈的單鏈RNA片段組成，共編碼10個病毒蛋白。依據其套膜上的血凝素(H)/和神經氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分為16個H亞型(H1～H16)和9個N亞型(N1～N9)。在禽類中高致病性禽流感病毒為H5、H7亞型，典型的雞禽流感病毒為H7N7型，人感染禽流感病毒主要為H5N1、H9N2、H7N7、H7N9型。

N9亞型是禽流感病毒眾多亞型之一，以往多在禽類間感染傳播。但2013年3月在我國多地發現并報道了一種新型的H7N9型禽流感，該亞型禽流感病毒可以感染人類，截至2016年1月10日，全國已確診134人感染了H7N9型禽流感，其中37人死亡。雖然目前針對N9亞型的基礎研究已取得了一定的進展，例如已經測定獲得了其NA基因的全部序列以及血凝素基因的部分序列，但我們的研究還有很大的局限，對病毒進化、致病機制、流行規律等仍不甚了解，因此，只有進一步加強在人群和動物中對該亞型禽流感病毒的監測，同時致力于基礎研究和相關疫苗及藥物的研發，才能使我們從容地應對未來可能出現的禽流感疫情。為了實現上述目的，研究開發針對禽流感病毒N9亞型的檢測試劑，并建立操作簡便、快速、敏感性好、特異性強的檢測方法和檢測系統是很有必要的，將其推廣應用于禽流感的早期篩查會對疫情的預防和控制產生積極的影響。

發明內容

針對上述問題，本發明人研究開發了一種基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的禽流感病毒N9亞型檢測試劑，并在該檢測試劑的基礎上建立了禽流感病毒N9亞型的檢測試劑盒及檢測系統。本發明檢測試劑盒及檢測系統操作簡單、檢測速度快、敏感性好、特異性強、方便易攜帶且檢測成本較低。

利用本發明檢測試劑盒及檢測系統可在實驗室、醫院、畜牧場、飼養場、活禽市場等各種場所即時的對禽流感病毒N9亞型進行檢測，并能夠準確、快速的獲得檢測結果。

第一方面，本發明提供了一種基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的禽流感病毒N9亞型檢測試劑，所述檢測試劑中包含檢測禽流感病毒N9亞型的特異性引物和探針，其中，所述特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報告基團FAM標記，3'端連接有非熒光淬滅基團和MGB修飾基團。

進一步地，本發明涉及上述檢測試劑在制備禽流感病毒N9亞型檢測試劑盒中的應用。

尤其是，本發明還涉及上述檢測試劑在制備禽流感病毒H7N9亞型檢測試劑盒中的應用。

此外，本發明還涉及上述檢測試劑在制備N9亞型禽流感診斷或治療藥物中的應用。

第二方面，本發明提供了一種基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的禽流感病毒N9亞型檢測試劑盒，所述檢測試劑盒中包含標準品和熒光定量PCR反應試劑；所述熒光定量PCR反應試劑包含dNTPs、Taq酶、緩沖液、特異性引物和探針；其中，所述特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報告基團FAM標記，3'端連接有非熒光淬滅基團和MGB修飾基團。

進一步地，上述檢測試劑盒中還包含陽性對照品和/或陰性對照品。

優選地，上述檢測試劑盒中的標準品為包含禽流感病毒N9亞型NA基因或該基因片段的重組質粒。