[發(fā)明專利]反射式共焦CARS顯微光譜測試方法與裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710366677.0
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號(hào): CN106990095B
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙維謙;黃偉華;王允;邱麗榮
• 申請（專利權(quán)）人: 北京理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/65
• 分類號(hào): G01N21/65
• 代理公司: 北京理工正陽知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11639
• 代理人: 唐華

本發(fā)明屬于顯微光譜成像探測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種反射式共焦CARS顯微光譜測試方法及裝置。本發(fā)明的核心思想是融合激光共焦顯微技術(shù)與CARS光譜探測技術(shù)，采用二向分光系統(tǒng)對(duì)瑞利光和CARS光進(jìn)行無損分離，其中CARS光進(jìn)行光譜探測，瑞利光進(jìn)行幾何定位。本發(fā)明利用共焦曲線頂點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)這一特性，精確捕獲和定位激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置，實(shí)現(xiàn)高精度的幾何探測和高空間分辨的光譜探測，構(gòu)成一種可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)高空間分辨光譜探測的方法和裝置。通過結(jié)合CARS顯微技術(shù)，激發(fā)出的載有樣品信息的拉曼散射光要遠(yuǎn)強(qiáng)于傳統(tǒng)自發(fā)拉曼光，且激發(fā)時(shí)間短，為快速檢測生物樣品和化學(xué)材料提供可能。本發(fā)明具有定位準(zhǔn)確、高空間分辨、光譜探測靈敏度高和測量聚焦光斑尺寸可控等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)，材料檢測等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于顯微光譜成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種反射式共焦CARS顯微光譜測試方法與裝置，可用于快速檢測各類樣品的微區(qū)反斯托克斯散射(CARS)光譜，可實(shí)現(xiàn)高空間分辨的幾何成像與探測，可獲得高空間分辨的“圖譜合一”圖像。

技術(shù)背景

光學(xué)顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和材料科學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，而隨著現(xiàn)代科學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)顯微成像的要求也從結(jié)構(gòu)成像轉(zhuǎn)向功能成像。1990年，共焦拉曼光譜顯微技術(shù)的成功應(yīng)用，極大的提高了探索微小物體具體組織成分及形貌的可能。它將共焦顯微技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，具備共焦顯微術(shù)的高分辨層析成像特征，又兼有無傷檢測和光譜分析能力，已成為一種重要的材料結(jié)構(gòu)測量與分析的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、石油化工、食品、藥物、刑偵等領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的自發(fā)拉曼散射成像技術(shù)由于拉曼散射本身特性導(dǎo)致其發(fā)射信號(hào)極弱，即便用高強(qiáng)度的激光激發(fā)，要得到一副對(duì)比度好的光譜圖像，依然需要很長的作用時(shí)間。這種長時(shí)間作用限制了拉曼顯微技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。基于相干拉曼效應(yīng)的相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)過程能夠很大程度上增強(qiáng)拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)快速檢測。相干拉曼效應(yīng)是通過受激激發(fā)的光將分子鎖定在振動(dòng)能級(jí)上，這種方法產(chǎn)生的振動(dòng)信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度成非線性關(guān)系，可以產(chǎn)生很強(qiáng)的信號(hào)，也稱為相干非線性拉曼光譜。它具有很強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)換效率，曝光時(shí)間短，對(duì)樣品的損害也比較小，同時(shí)它的散射具有一定的方向性，容易與雜散光分離。

相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的產(chǎn)生是一個(gè)三階非線性光學(xué)過程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探測光。一般而言，為了減少光源的數(shù)量，簡化過程，常用泵浦光代替探測光，它們之間的關(guān)系如圖2所示，當(dāng)泵浦光(w_p)和斯托克斯光(w_s)的頻率之差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，將激發(fā)出CARS光w_as，其中w_as＝2w_p-w_s。CARS光的產(chǎn)生過程包含特定的拉曼活性分子的振動(dòng)模式和導(dǎo)致分子從基態(tài)至激發(fā)態(tài)振動(dòng)躍遷的入射光場的相互作用過程，它的能級(jí)示意圖如圖3所示。圖3(a)表示拉曼共振和非共振單光子增強(qiáng)對(duì)CARS過程的貢獻(xiàn)，圖3(b)表示拉曼共振和非共振雙光子增強(qiáng)對(duì)CARS過程的貢獻(xiàn)；當(dāng)w_p和w_s之間的頻差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，激發(fā)出的信號(hào)得到共振增強(qiáng)，同時(shí)非共振部分也會(huì)由于電子躍遷響應(yīng)得到增強(qiáng)，因此要得到較好的CARS信號(hào)，需要盡可能的抑制非共振背景信號(hào)，常見的方法是偏振CARS(P-CARS)方法。

P-CARS的原理如圖4所示，光源1發(fā)出的頻率為w_s的斯托克斯光，起偏后經(jīng)過四分之一波片和半波片后與光源2發(fā)出的頻率為w_p的泵浦光(探針光)匯合，經(jīng)二向分光鏡后由反射鏡發(fā)射至水浸顯微物鏡，聚焦在樣品上，激發(fā)出載有光譜特性的CARS光后，透射進(jìn)入信號(hào)采集系統(tǒng)；信號(hào)由一個(gè)油浸的顯微物鏡采集，經(jīng)過一個(gè)偏振片過濾非共振背景，然后通過一個(gè)濾光片濾除其他譜段的干擾后，被一個(gè)雪崩光電二極管所采集，即獲得特定頻譜的光譜信號(hào)。

P-CARS能夠很大程度的抑制非共振信號(hào)和激發(fā)光的干擾，但是由于其采用的是兩個(gè)單波長脈沖激光器，只能獲得特定頻譜的光譜信息，因此它的廣泛使用受到了極大的限制。