[發明專利]一種用于高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依賴型產生菌及其發酵方法

有效

• 申請號: 201710364518.7
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107267411B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 曾偉;梁智群;陳桂光;郭燁;董夢娜;張斌
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/02;C12R1/125
• 代理公司: 南寧市來來專利代理事務所(普通合伙) 45118
• 代理人: 李瑞環

1.一種用于高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依賴型產生菌，其特征在于：所述菌命名為：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GXG-5，保藏編號為CCTCC NO：M 2017083，保藏日期為2017年3月6日，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學。

2.權利要求1所述非谷氨酸依賴型產生菌高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）菌種活化：將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GXG-5接于固體斜面培養基上，45~50℃培養12-24h；

（2）種子液制備：將步驟（1）所述斜面培養基上1~3cm²的菌苔接入裝有30mL液體種子培養基的250mL三角瓶中，搖床轉速160~200rpm，45~50℃培養12~24h至菌株對數生長中期；

（3）液體搖瓶發酵：將步驟（2）所得種子液接入滅菌后的液體發酵培養基中，接種量1~10%（v/v），三角瓶裝液量20~80mL/250mL，搖床轉速160~250rpm，40~55℃培養48~72h，得到成熟發酵液；

（4）γ-聚谷氨酸提取純化：收集步驟（3）所得成熟的發酵液，加入2~5倍體積蒸餾水稀釋，利用孔徑為0.45μm微濾膜去除菌體，上清液采用截留分子量為10~50KDa超濾膜濃縮至原發酵液體積的30~50%，加入2~4倍體積的工業級乙醇進行沉淀，收集沉淀，冷凍干燥得到γ-聚谷氨酸成品。

3.根據權利要求2所述非谷氨酸依賴型產生菌高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步驟（1）所述固體斜面培養基的濃度組成為：葡萄糖10~15g/L，酵母膏2~5g/L，胰蛋白胨3~6g/L，NaCl 3~6g/L，瓊脂15~20g/L，pH值6.5~7.5，蒸餾水配制。

4.根據權利要求2所述非谷氨酸依賴型產生菌高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步驟（2）所述液體種子培養基濃度組成為：葡萄糖10~20g/L，酵母膏2~5g/L，胰蛋白胨5~10g/L，NaCl 5~10g/L，pH值6.5~7.5，蒸餾水配制。

5.根據權利要求2所述非谷氨酸依賴型產生菌高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步驟（3）所述液體發酵培養基濃度組成為：糖質原料10~50g/L，氮源5~30g/L，KNO₃2~10g/L，NaCl 2~10g/L，K₂HPO₄ 0.5~5g/L，pH值6.5~7.5，蒸餾水配制。

6.根據權利要求5所述非谷氨酸依賴型產生菌高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述液體發酵培養基中糖質原料為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖和糖蜜中的任意一種或幾種混合物。

7.根據權利要求5所述非谷氨酸依賴型產生菌高溫發酵生產γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述液體發酵培養基中氮源為大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄和NH₄NO₃中的任意一種或幾種混合物。