[發(fā)明專利]一種檢測CALR基因2型突變的引物組合物及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710364251.1
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107164474B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 關明;曹國君;方雪恩;唐宜桂;許笑;孔繼烈;張心菊;李楊
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫(yī)院;復旦大學;上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 竺路玲

本發(fā)明涉及一種用于檢測CALR基因2型突變的引物組合物，其包括含有SEQ ID NO：2?SEQ ID NO：7所示序列的引物；本發(fā)明還涉及一種含有上述引物組合物的試劑盒及其檢測方法，以及上述引物組合物擴增的CALR基因2型突變的靶序列，該靶序列為SEQ ID NO：1所示序列。本發(fā)明所述的試劑盒及其檢測方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性，梯度突變負荷濃度的樣本用所建立的LAMP反應體系進行擴增，發(fā)現(xiàn)突變負荷檢出敏感性可達到3％，幾乎與探針法實時PCR的效果相當，且其可對CALR基因2型突變進行可視化檢測，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，該方法對設備和環(huán)境要求低，檢測速度更快，檢測靈敏度更高。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種檢測CALR基因2型突變的靶序列、擴增組合物及試劑盒。

背景技術

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是骨髓中一種或多種髓系細胞增殖和外周血中成熟及不成熟細胞增加的克隆性造血干/祖細胞疾病。近年來，多個分子標志物，如JAK2、MPL和TET突變等相繼被發(fā)現(xiàn)，這些標志物的發(fā)現(xiàn)對于理解MPN的分子發(fā)病機制具有重要意義，也有助于對這類疾病的患者進行診斷和治療。但是，有30％～45％的攜有野生型JAK2/MPL的原發(fā)性血小板增多癥(ET)或原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者仍然存在診斷困難，新近報道的鈣網(wǎng)蛋白基因(CALR)突變將能部分填補這一空白，有望成為診斷骨髓增殖性腫瘤又一種新的分子標志物。

CALR是一種主要位于內(nèi)質網(wǎng)的有多重功能的鈣離子結合和儲存蛋白分子伴侶，通過協(xié)助蛋白質正確折疊和維持細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)而參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、黏附、免疫等過程。CALR基因定位于染色體19p13.2，它有9個外顯子和9個蛋白結構域，CALR基因突變是由第九外顯子插入和缺失引起，導致一個堿基對的讀碼框移位，繼而產(chǎn)生一種具有缺乏內(nèi)質網(wǎng)保留序列(KDEL氨基酸序列)的新型的C-羧基末端的蛋白,到目前為止，已經(jīng)檢測到多于40種不同的CALR突變體,其中最常見的兩種變異體分別為：由52個堿基缺失引起的1型變異體(p.L367fs*46)和由5個堿基TTGTC插入引起的2型變異體(p.K385fs*47)，它們分別占所有突變體的53％和32％，研究者在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，過度表達的1型突變體增強了白介素-3表達，也促進了STAT5磷酸化作用并且引起信號傳導的激活，這種激活作用能被JAK抑制劑阻滯，這說明CALR和JAK2突變可能有類似的機制。

當前CALR基因突變的檢測主要依賴于探針實時PCR法或測序法等，以上方法耗時耗力、報告周期長，且在靈敏度方面存在缺陷，所需檢測設備昂貴，檢測時必須要有專門的設備和訓練有素的技術人員，對技術平臺要求高，不易于廣泛推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的缺陷，建立了一種針對CALR基因2型突變進行快速檢測的環(huán)介導等溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)體系。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明提供一種檢測CALR基因2型突變的靶序列的引物組合物，其包括SEQ IDNO：2-SEQ ID NO：7所示序列的引物。

本發(fā)明還提供一種含有上述引物組合物的檢測CALR基因2型突變的試劑盒。

優(yōu)選地，上述試劑盒還包括反應緩沖液、Bst DNA聚合酶、鈣黃綠素、去離子水、DNA模板。

優(yōu)選地，上述試劑盒包含25μL擴增反應體系，該擴增反應體系包括包括2×反應緩沖液12.5μL，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4所示序列中的每一引物各0.5μL，SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：7所示序列中的每一引物各1μL，Bst DNA聚合酶1μL，鈣黃綠素1μL，去離子水4.0μL，DNA模板2μL。