[發(fā)明專利]中國人胰腺癌細(xì)胞系sipanc-187建立方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710363675.6
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN108384756A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁廷波;白雪莉;陳琦;王健鑫;魏濤;王藝;王建鋒;倪磊
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 陳繼亮

本發(fā)明公開了一種中國人胰腺癌細(xì)胞系sipanc?187建立方法，包括以下步驟：1.標(biāo)本采集2.組織消化3.PDX裸鼠荷瘤4.成瘤細(xì)胞培養(yǎng)與傳代。本發(fā)明有益的效果：本發(fā)明構(gòu)建的中國人胰腺癌細(xì)胞系sipanc?187生物學(xué)特征為胰腺導(dǎo)管腺癌，其成瘤性良好，具有一定的耐藥性，可較好地應(yīng)用胰腺癌腫瘤、化療耐藥機(jī)制研究及中國人胰腺癌相關(guān)基因譜系分析等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種胰腺癌原代腫瘤細(xì)胞建系的方法，主要是一種中國人胰腺癌細(xì)胞系sipanc-187建立方法。

背景技術(shù)

胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是最常見的胰腺腫瘤，早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，而癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已是晚期，預(yù)后極差，確診后五年生存率往往不足5％，被稱為“癌中之王”^[1-3]，位于我國男性癌癥患者死亡率的第六位^[4]。過去基礎(chǔ)和臨床研究中所用到的胰腺癌細(xì)胞系多來源于國外ATCC細(xì)胞庫，比如Panc-1，Bxpc-3，Miapaca-2，ASPC-1等，其細(xì)胞系來源于白種人胰腺癌患者，對我國胰腺癌研究來講，可能存在一定的種群結(jié)構(gòu)、基因等水平差異。此外，由于胰腺癌本身乏血供^[5]、且多腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts，CAF)富集的特性，傳統(tǒng)的腫瘤原代細(xì)胞建系方法在胰腺癌中的應(yīng)用受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種中國人胰腺癌細(xì)胞系sipanc-187建立方法。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的。這種中國人胰腺癌細(xì)胞系sipanc-187建立方法，該方法包括如下步驟：

(1)、標(biāo)本采集并制成組織塊；

(2)、組織消化：將上述組織塊用5mlPBS重懸，加入700ul滅菌水配置的IV型膠原酶，工作濃度1437u/ml；25ul的無菌CaCl₂溶液，工作濃度1M；25-30mgBSA粉末，搖床37℃，200轉(zhuǎn)/分，孵育30分鐘后，將上述組織懸液自搖床取出，70um級濾網(wǎng)過濾除去未消化組織塊，將濾過的細(xì)胞懸液加10mlPBS洗滌后，1500轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，棄去上清，加入5ml裂紅液冰上裂解5分鐘，再次加10mlPBS洗滌，1500轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，棄去上清后使用1mlPBS重懸；

(3)、PDX模型建立：將上述細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)取1*10⁶個細(xì)胞，并取100ulPBS重懸稀釋，接種5-6周大小裸鼠皮下，接種部位為腋下，荷瘤12-14天后皮下荷瘤模型成瘤；

(4)、組織處理：脫頸椎法處死裸鼠，安全通風(fēng)柜內(nèi)手術(shù)完整分離PDX腫瘤組織，立即浸入20ml完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基采用RPMI 1640配置，含終濃度10％FBS(v/v％)及青霉素/鏈霉素雙抗各100mg/ml，安全通風(fēng)柜內(nèi)使用20mlPBS反復(fù)沖洗組織，洗凈并去除肉眼可見血塊及壞死組織，取直徑1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小腫瘤，將其剪碎成為1mm³大小組織塊；

(5)、組織消化：將上述小組織塊用5mlPBS重懸，加入700ul滅菌水配置的IV型膠原酶，工作濃度1437u/ml；25ul的無菌CaCl₂溶液，工作濃度1M；25-30mgBSA粉末，搖床37℃，200轉(zhuǎn)/分，孵育30分鐘后，將上述組織懸液自搖床取出，70um級濾網(wǎng)過濾除去未消化組織塊，將濾過的細(xì)胞懸液加10mlPBS洗滌后，1500轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，棄去上清，加入5ml裂紅液冰上裂解5分鐘，再次加10mlPBS洗滌，1500轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，棄去上清后使用1ml完全培養(yǎng)基重懸；