[發明專利]一種蛋白制劑及在CIK細胞培養方面的應用

有效

• 申請號: 201710360902.X
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107011412B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 胡攀勇;黃欣;張鐘祥
• 申請（專利權）人: 蘇橋生物（蘇州）有限公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12N5/0783
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

1.一種蛋白制劑在體外培養擴增CIK細胞方面的應用，其特征在于，該蛋白制劑通過如下步驟制備得到：

步驟1、單個核細胞的分離：采集健康志愿者外周血20mL，預冷的PBS 1:1稀釋，緩慢加入淋巴細胞分離液上層，650g、4℃離心20min，收集白色細胞層，分離單個核細胞，RPMI-1640培養基重懸細胞后置于37℃、5% CO₂孵箱中孵育2h；

步驟2、DC細胞的培養：單個核細胞培養2h后收集貼壁細胞，在含有10% FBS的RPMI-1640完全培養基中添加1000U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4誘導DC生成，于37℃、5% CO₂孵育箱中培養，每2天半量換液一次，換液后補充GM-CSF、IL-4，于第6d在培養基中添加100ng/mLTNF-α誘導DC成熟，連續培養7d；

步驟3、總蛋白提取：提取前3小時，將成熟DC置于37℃、25%-45% CO₂孵育箱中培養2-4小時；2-4小時后，按照如下方法提取總蛋白，分裝后-70℃保存，避免反復凍融：

（1）吸取培養基，預冷PBS清洗細胞三次，收集至離心管，1000rpm離心5分鐘，洗滌后的細胞轉移至潔凈EP管；

（2）冰上操作，配制細胞裂解液，1mL Lysis Buffer中加入10μL磷酸酶抑制劑、1μL蛋白酶抑制劑、5μL 100mM的PMSF，混勻后冰上保存數分鐘待用；

（3）在洗滌好的細胞中按照每10⁷個細胞加入1mL細胞裂解液的比例，加入細胞裂解液，移液器反復吹打使細胞充分裂解；

（4）4℃搖床溫和振搖15分鐘，然后用4℃離心機14000rpm離心15分鐘，上清即為細胞全蛋白提取物；

（5）BCA法測蛋白濃度；提取細胞全蛋白整個過程中所有使用的物品及試劑均需預冷，防止蛋白降解。