[發(fā)明專利]多形漢遜酵母重組菌株及其在甘油生物合成中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710358876.7
• 申請(qǐng)日: 2017-05-19
• 公開（公告）號(hào): CN107189953B
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李永東;錢衛(wèi)東;倪紅霞;劉昱慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波市疾病預(yù)防控制中心;陜西科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12P7/20;C12R1/78
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發(fā)明提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在甘油生物合成中的應(yīng)用，主要是運(yùn)用低能離子注入技術(shù)介導(dǎo)酵母基因組總DNA轉(zhuǎn)化酵母菌的方法構(gòu)建能夠耐高鹽的甘油高產(chǎn)重組菌株。本發(fā)明提供的重組菌株通過底物分批補(bǔ)料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甘油，其甘油產(chǎn)量和底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率在發(fā)酵中分別可達(dá)到97.29g/L和83.27％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，具體涉及利用低能離子注入介導(dǎo)酵母基因組總DNA轉(zhuǎn)化酵母菌的方法構(gòu)建耐高鹽重組酵母菌株及其在甘油生物合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

甘油(Glycerin)，又稱丙三醇、三羥基丙烷，分子式為C₃H₈O₃，相對(duì)密度1.26，熔點(diǎn)17.8℃，沸點(diǎn)290.0℃。甘油是一種無色或微黃色透明粘稠液體，無毒、無臭、無腐蝕性，具有較強(qiáng)的吸濕性。甘油作為重要的有機(jī)化工原料，廣泛用于軍工、食品、醫(yī)藥、日用化工等行業(yè)。我國甘油生產(chǎn)能力約為8.6-9萬噸，其中皂化法生產(chǎn)能力為6萬噸，化學(xué)合成法生產(chǎn)能力為1.5-1.8萬噸，好氧發(fā)酵法生產(chǎn)能力超過1萬噸。由于化學(xué)合成甘油的原料價(jià)格昂貴，以此為基礎(chǔ)的合成洗滌劑的發(fā)展也受到了限制，這制約了肥皂工業(yè)的發(fā)展。因此人們將目光集中到發(fā)酵法生產(chǎn)甘油。

Nicherson和Carroll在1945年第一次提出可以用耐高滲酵母生產(chǎn)甘油。這主要由于甘油可以對(duì)滲透壓進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且它可以在細(xì)胞內(nèi)部積聚，可以起到平衡外界滲透壓的作用，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞不受到滲透壓作用而破裂，因而可以通過選擇耐高滲的酵母菌株進(jìn)行甘油發(fā)酵。范光先等人通過研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的鹽能引起耐高滲酵母碳源代謝途徑由HMP途徑向EMP途徑轉(zhuǎn)換，致使甘油產(chǎn)量增加。

低能離子注入為冷加工過程，伴隨多種物理與化學(xué)反應(yīng)。通過控制低能注入離子劑量，可直接將裸露DNA大分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，而且細(xì)胞定位注入及單離子束定點(diǎn)注入在對(duì)臨近靶物質(zhì)的基團(tuán)或者細(xì)胞不產(chǎn)生傷害的情況下能夠引起靶物質(zhì)發(fā)生顯著的生物學(xué)變化，具有明顯的優(yōu)越性和新穎性。同時(shí)，低能離子注入對(duì)生物體的誘變表現(xiàn)出損傷輕、突變范圍廣、多發(fā)性及局部性等優(yōu)點(diǎn)，并且已被大量的研究結(jié)果證實(shí)。

趙德志等利用低能離子注入介導(dǎo)酵母基因組總DNA轉(zhuǎn)化酵母菌的方法，獲得了一株甘油高產(chǎn)酵母工程菌，但是，甘油產(chǎn)量和底物利用率仍有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在甘油生物合成中的應(yīng)用。

一種多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)，所述重組菌株的保藏編號(hào)為CGMCC No.14015。

所述重組菌株(CGMCC No.14015)的獲得方法，包括以下步驟：

1)運(yùn)用低能離子注入介導(dǎo)酵母基因組DNA轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母出發(fā)菌株；

2)重組菌株初篩：將經(jīng)低能離子注入介導(dǎo)酵母基因組DNA轉(zhuǎn)化后的出發(fā)菌株用高鹽固體培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選；

3)將初步篩選得到的重組酵母菌株進(jìn)一步進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用紙色譜法和氣相色譜法分析發(fā)酵所得發(fā)酵液，從而對(duì)重組酵母菌株進(jìn)一步篩選鑒定。

所述出發(fā)菌株為多形漢遜酵母H.polymorpha DL-1(來源為ATCC No.26012)。

所述酵母基因組DNA提取自多形漢遜酵母H.polymorpha DL-1(來源為ATCCNo.26012)。

所述低能離子注入的條件為：注入離子為N⁺，注入劑量為1.5×10¹⁶～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量為15～25KeV，脈沖時(shí)間為5～10s，間隔時(shí)間為5～10s，真空度為1.5～2.0×10^-4Pa。